1. Hyaluronik Asit-Seramid (HACE) Sentezi
- 12.21 mmol hyaluronik asit (HA) oligomeri ve 9.77 mmol tetra-n-bütilamonyum hidroksit (TBA) 60 ml çift damıtılmış suda (DDW) çözündürün. 30 dakika karıştırın.
- DS-Y30 bağlayıcısını sentezlemek için, 8.59 mmol DS-Y30 seramid ve 9.45 mmol trietilamini 25 ml tetrahidrofuran (THF) içinde çözün. THF'de 8.59 mmol 4-klorometilbenzoil klorür ile karıştırın. 60 °C'de 6 saat karıştırın.
- Sentezlenen 8.10 mmol HA-TBA ve 0.41 mmol DS-Y30 bağlayıcıyı THF ve asetonitril karışımı (4: 1, h / h) içinde çözün. 40 °C'de 5 saat karıştırın.
- Bir filtre ajanı ile filtreleyerek safsızlıkları giderin ve organik çözücüyü vakumla buharlaştırarak ortadan kaldırın. Ürünü bir diyaliz membranı (moleküler ağırlık kesme: 3,5 kDa) kullanarak saflaştırın ve liyofilize edin.
2. Nanopartiküllerin Hazırlanması
- 1 mg HB ve 1 mg paklitakseli 0.5 ml dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözün ve 5 dakika boyunca girdapla karıştırarak 0.5 ml DDW ile karıştırın. Daha sonra, HACE'yi bu karışımda 5 dakika daha girdapla karıştırarak çözündürün.
- Çözücüyü ortadan kaldırmak için, hafif bir nitrojen gazı akışı altında 4 saat boyunca 70 °C'de ısıtın.
- HACE, HB ve paklitakselden oluşan filmi 1 ml DDW ile yeniden süspanse edin. Kapsüllenmemiş ilaçları çıkarmak için bir şırınga filtresi (0.45 μm gözenek boyutu) ile filtreleyin.
3. In Vitro Fototoksisite
- Akciğer kanseri hücre hatlarında nanopartiküllerin alımı
- RPMI-1640 orta içeren% 10 (h / h) fetal sığır serumu ve% 1 (a / h) penisilin-streptomisin hazırlayın.
- A549 hücrelerini, 1 × 105 hücre / kuyucuk yoğunluğunda 24 oyuklu hücre kültürü plakalarında tohumlayın (her grup için üç katlıdır). Nemlendirilmiş% 5 CO2 ve% 95 hava atmosferinde 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
- Hücre bağlandıktan sonra, ortamı çıkarın ve 1 ml fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek hücreleri yıkayın.
- Nanopartikülleri PBS'de 2 μM / ml HB'lik bir nihai konsantrasyona çözün. Daha sonra, hücreleri karanlıkta 4 saat boyunca her bir oyukta 1 ml PBS, boş NP'ler, HB-NP'ler veya HB-P-NP'ler ile inkübe edin.
- Tüm solüsyonu çıkarın ve 1 ml soğuk PBS ekleyerek hücreleri yıkayın. Yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın. Taze kültür ortamı ekleyin.
- Hücre canlılığı testi
- Hücre kültürü plakasını PDT fiberinin altına yerleştirin (PDT fiberinden kuyuya 1 cm mesafe ile). Lazer koruyucu gözlük takın ve hücreleri karanlıkta çeşitli sürelerde PDT lazerle (630 nm, 400 mW/cm2) aydınlatın: 0, 5, 10, 20, 30 ve 40 saniye (0, 2, 4, 8, 12 ve 16 J/cm2). Ardından, hücreleri karanlıkta 24 saat inkübe edin.
- Ortamı aspire edin ve 1 ml soğuk PBS ekleyerek hücreleri yıkayın. Yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.
- Her oyuğa 10 μl sitotoksisite ölçüm çözeltisi ekleyin. Karanlıkta 2 saat inkübe edin.
- Bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı 450 nm'de ölçün.
