$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Hyaluronik Asit-Seramid (HACE) Sentezi
- 12.21 mmol hyaluronik asit (HA) oligomeri ve 9.77 mmol tetra-n-bütilamonyum hidroksit (TBA) 60 ml çift damıtılmış suda (DDW) çözündürün. 30 dakika karıştırın.
- DS-Y30 bağlayıcısını sentezlemek için, 8.59 mmol DS-Y30 seramid ve 9.45 mmol trietilamini 25 ml tetrahidrofuran (THF) içinde çözün. THF'de 8.59 mmol 4-klorometilbenzoil klorür ile karıştırın. 60 °C'de 6 saat karıştırın.
- Sentezlenen 8.10 mmol HA-TBA ve 0.41 mmol DS-Y30 bağlayıcıyı THF ve asetonitril karışımı (4: 1, h / h) içinde çözün. 40 °C'de 5 saat karıştırın.
- Bir filtre ajanı ile filtreleyerek safsızlıkları giderin ve organik çözücüyü vakumla buharlaştırarak ortadan kaldırın. Ürünü bir diyaliz membranı (moleküler ağırlık kesme: 3,5 kDa) kullanarak saflaştırın ve liyofilize edin.
2. Nanopartiküllerin Hazırlanması
- 1 mg HB ve 1 mg paklitakseli 0.5 ml dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözün ve 5 dakika boyunca girdapla karıştırarak 0.5 ml DDW ile karıştırın. Daha sonra, HACE'yi bu karışımda 5 dakika daha girdapla karıştırarak çözündürün.
- Çözücüyü ortadan kaldırmak için, hafif bir nitrojen gazı akışı altında 4 saat boyunca 70 °C'de ısıtın.
- HACE, HB ve paklitakselden oluşan filmi 1 ml DDW ile yeniden süspanse edin. Kapsüllenmemiş ilaçları çıkarmak için bir şırınga filtresi (0.45 μm gözenek boyutu) ile filtreleyin.
3. Tümör taşıyan farelerde in vivo antikanser etkinliği
- Akciğer kanserine bağlı fare modeli
- 0.1 ml RPMI-1640 ortamında 1 ×10 6 A549 hücresi hazırlayın; buzda tutun.
- Fareleri bir ip ile anestezi yapın. bir ksilazin enjeksiyonu ve bir tiletamin ve zolazepam karışımı (1: 2, 1 ml / kg). Küçük bir fare derisi katını nazikçe sıkıştırarak uygun anesteziyi onaylayın. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhemi kullanın.
not: Herhangi bir hareket gözlenmezse, hayvan deneylere başlamak için yeterince uyuşturulur.
- Hücreleri deri altından BALB / C erkek çıplak farelerin (6 - 7 haftalık, 20 - 22 g) sol kanatlarına enjekte edin.
- Kafesin etrafında hareket etmeye başlayana kadar fareleri gözlemlemeye devam edin.
not: Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar bir hayvanı gözetimsiz bırakmayın. Ameliyat geçirmiş bir hayvanı, tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların yanına iade etmeyin. Fareleri belirli patojen içermeyen (SPF) koşullar altında tutun.
- Tümör boyutunu her gün kumpaslarla ölçün. Tümör hacmini (mm3) (uzunluk × genişlik2) / 2 olarak hesaplayın. Tümör boyutu yaklaşık 200 mm'yeulaştığında 3 hacim olarak deneye başlayın.
- Antikanser etkinlik çalışması
- Fareleri rastgele 4 gruba ayırın (her grup için n = 10).
- Fareleri bir ip ile anestezi yapın. bir ksilazin enjeksiyonu ve bir tiletamin ve zolazepam karışımı (1: 2, 1 ml / kg). Küçük bir fare derisi katını nazikçe sıkıştırarak uygun anesteziyi onaylayın. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhemi kullanın.
not: Herhangi bir hareket gözlenmezse, hayvan deneylere başlamak için yeterince uyuşturulur.
- Nanopartikülleri PBS'de 2 mg / ml HB'lik bir nihai konsantrasyona çözün. 0. ve 7. günlerde iki kez kuyruk damarı yoluyla (HB olarak 2 mg / kg) PBS, serbest HB, HB-NP'ler veya HB-P-NP'leri enjekte edin.
- Kafesin etrafında hareket etmeye başlayana kadar fareleri gözlemlemeye devam edin.
not: Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar bir hayvanı gözetimsiz bırakmayın. Ameliyat geçirmiş bir hayvanı, tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirketine iade etmeyin. Kafesleri karanlıkta ve belirli SPF koşulları altında tutun.
- Her enjeksiyondan 24 saat sonra, fareleri bir IP bir ksilazin enjeksiyonu ve bir tiletamin ve zolazepam karışımı (1: 2, 1 ml / kg) ile uyuşturun. Küçük bir fare derisi katını nazikçe sıkıştırarak uygun anesteziyi onaylayın. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhemi kullanın.
not: Herhangi bir hareket gözlenmezse, hayvan deneylere başlamak için yeterince uyuşturulur.
- Tümör bölgesini PDT fiberinin altına yerleştirin (PDT fiberinden tümöre 1 cm mesafe ile). Lazer koruyucu gözlük takın, anahtarı kapatın ve tümörü 630. ve 400. günlerde iki kez 500 saniye (200 J /cm2) boyunca bir PDT lazerle (1 nm, 8 mW / cm2) aydınlatın.
- Kafesin etrafında hareket etmeye başlayana kadar fareleri gözlemlemeye devam edin. Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar bir hayvanı gözetimsiz bırakmayın. Ameliyat geçirmiş bir hayvanı, tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirketine iade etmeyin.
- Kafesleri SPF koşulları altında tutun. Lazer tedavisinden sonra kafesleri 24 saat karanlıkta tutun.
- Tümör hacmini ve tümör bölgesindeki değişiklikleri her gün görsel olarak izleyin. Tümör boyutunu kaliperlerle ölçün ve hacmi (uzunluk × genişlik2) / 2 (mm3) olarak hesaplayın. PDT sonrası tümör yüzeyi değişikliklerini kontrol etmek için her gün tümör bölgelerinin fotoğraflarını çekin.
- 16. günde, izofluran kullanarak terminal anestezi ile grup başına beş fareyi kurban edin.
- Forseps ve makasla dış cildi kesin ve tümörleri ortaya çıkarın. Onları dikkatlice hasat edin. Bunları% 10 formalin içinde sabitleyin, parafine gömün ve histolojik analiz için hematoksilen ve eozin (H & E) ile boyayın.
- 45 günlük izlemeden sonra, kalan fareleri izofluran kullanarak terminal anestezi ile feda edin.