Yöntem makalesi

Mikro Ölçekli Besin Katmanlar Deniz Mikro-organizmalar kemotaktik Tepki

DOI:

10.3791/203

⸱

28 Mayıs 2007

 ,  , 
1Environmental Microfluidics Group, MIT - Massachusetts Institute of Technology

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kayma akışı içinde derme çatma bir besin bir deniz manzarası ve yüzme davranışı içinde bakteri deniz mikropların kemotaktik toplayıcı davranış eğitimi için mikroakışkan kanalları ve deneylerde bunların uygulanmasını imalat açıklanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microscale kaynak yamalar yararlanmak için planktonik mikropların derecesi okyanus trophodynamics ve biyojeokimyasal akı önemli etkileri olacaktır. Ancak, yüzme mikropların yamalar kullanılabilirliği ve onları bulmak için bakteri yeteneğini sınırlayabilir moleküler difüzyon ve türbülanslı kayma da dahil olmak üzere fiziksel güçlerin etkilerini aşmak gerekir, okyanus besin yamalar yararlanmak için. Yakın zamana kadar, metodolojik sınırlamalar yamalı habitatlar ve gerçekçi küçük ölçekli akış koşulları içinde mikrobiyal davranışı doğrudan muayene engellemiştir. Bu nedenle, teorik tahminlerin çok okyanus mikrobiyal davranışı ile ilgili mevcut bilgi temin edilmiştir. 2 mikroakışkan oluşturmak için kullanılan cihazlar, (i) okyanus süreçleri ile ilgili boyutları ve Difuzyonun özellikleri ile besin yamaları microscale ve (ii) microscale geliştirmek için yumuşak litografik üretim teknikleri uyguladık okyanus mikrobiyal yiyecek arama davranışı üzerinde yeni bir bilgi elde etmek için okyanusta beklenen karşılık gelen kesme oranları ile vortekslerini. Bu mikroakışkan cihazlar, heterojen ve dinamik bir deniz manzarası içinde mikrobiyal yüzme ve kemotaktik davranış bir ilk doğrudan muayene izin var. Bireysel mikropların yüzme davranışına ek olarak, toplum düzeyinde agregatif yanıt gözlemlerken Epifloresans ve faz kontrast mikroskobu kombine kullanımı, fiziksel boyutları ve besin yamalar uzadıya özellikleri doğrudan muayene izin verir. Bu deneyler, fitoplankton, heterotrof bakteri ve phagotrophic protistler bazı türlerin çok kısa bir zaman çerçevesi içinde difüzyon microscale kaynak yamalar bulma ve istismar usta olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca kesme oranları orta derecede olduğunu göstermiştir, deniz bakteri kendi istekleriyle akışı ve yüzme çevreleri ile mücadele etmek mümkün. Ancak, yüksek kesme bir eşik düzeyinin ötesinde, bakteri kayma akması hizalanmış ve akış bozukluğu olmadan yüzme az yetenekli. Mikroakiskan sucul mikrobiyal ekoloji eğitim için yeni ve ucuz bir yaklaşım temsil eder ve doğru microscale ve yüzey eğimleri gerçekçi akış alanları oluşturmak için uygunluğu nedeniyle ideal etkileşim küçük ölçeklerde mikrobiyal davranış sınavlara uygulanabilir. Bu nedenle Mikroakiskan okyanusta mikroorganizmaların ekolojisi daha iyi bir anlayış elde etmek için değerli bir araç temsil ettiğini düşündürmektedir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hazırlık

1. Mask oluşturun

Bir CAD yazılımı kullanarak, yüksek çözünürlüklü bir şeffaflık baskı için kanal tasarımı. Bu, "maske" olacaktır.

Temiz oda:

2. Gofret temizleyin ve fırında

İlk, Aseton ile fışkırtma gofret, sonra hızla Metanol ile, daha sonra Isopropanol. Son olarak, gofret Azot kullanarak kurutun.

5 dakika fırında (130 ° C) gofret pişirin.

3. Kaplama gofret

Spin-kaplama makinesi merkezinde gofret yerleştirin. Şişe gofret üzerine dökün fotorezist (SU-8). SU-8 akım edelim ve ~ 10 saniye süreyle dinlenin Spin-lak açın ve 0 ile 5 sn içinde 500 rpm hız rampası, 10 s için 500 rpm'de 10 sn içinde son hıza kadar rampa ve son hızda korumak için 30 saniye Son hızı kullanılan hedeflenen kaplama kalınlığı ve SU-8 bağlıdır. Ayrıntılar bulunabilir http://www.microchem.com/

4. Yumuşak bake

Gofret kaplama sonra, 65 ° C ve daha sonra 95 ilk fırında ° C Pişirme süresi, kullanılan paslanmaz çeliğin hedeflenen kalınlık ve türüne göre değişir. Sonra, gofret, en az 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.

5. Maruz kalma

Maske gofret üstüne yerleştirin ve SU-8 kılavuzunda önerilen süre için UV ışığı gofret maruz.

6. Post-maruz kalma fırında

Gofret pişirin 65 ° C ve daha sonra 95 ° C SU-8 manuel talimatları izleyerek.

7. Gofret Gelişmekte olan "master" (küf) elde etmek için

Geliştirici (PMMA) ile dolu bir beher hazırlayın. Fotorezist Pozlanmamış parçası yıkanıp kadar çok nazikçe beher salınan behere gofret bırakın.

Laboratuarımızda:

8. PDMS hazırlayın ve gofret üzerine dökün

Bir kap içine 10:1 oranını PDMS sertleştirici ile karıştırın. Karıştırın ve homojen bir karışımı: Bu baloncuklar çok üretmek ve karışımı opak bir görünüm yapacak. "Ana" karışımı dökün.

9 - De-bubble vakum odasına

Kabarcıklarını çıkarmak için, bir vakum odasına kadar tüm kabarcıklar gitti kapsayan master ve PDMS karışımı yerleştirilir.

10 Fırın Pişirme

En az 12 saat, 65 ° C sertleşmesine PDMS fırında pişirin .

11. Delgeç

Kanalların giriş ve çıkışları için ana ve zımba delikleri PDMS soyun.

Temiz (gösterilmemiştir)

12. Plazma bağlar

Kanallar PDMS katman ve 1 dakika boyunca oksijen plazma ile cam slayt hem de tedavi sonrası bir bardak slayt yapıştırılır.

Deneyleri:

Uzm # 1: mikro ölçekli besin katmanları deniz mikropların kemotaktik yanıt incelenmesi

1) deneme ayarlama

  1. Cam şırınga organizmalar ve substratlar
  2. Mikroskop sahneye mikroakışkan kanal yerleştirin ve uygun giriş ve çıkışlarının boru eklemek
  3. Rezervuar atık boru bağlayın. Borular tamamen basınç salınımlarını engellemek için, sıvı atık rezervuar sular altında emin olun.
  4. Yeri şırınga ve şırınga pompası üzerine vana ve boru bağlantı
  5. Işık koşullarında, büyütme, vb: mikroskop
  6. Kanal uygun pozisyonda odaklanın
  7. De-kabarcık kanal kullanılarak yapay deniz suyu ile doldurulmuş büyük şırınga
  8. Şırınga pompası uygun akış hızını ayarlayın. Bu durumda kanal 220 mikron s -1 ortalama akış hızı karşılık gelen 2 ml / dk,

2) deney Koşu

  1. Bir besin degrade kanal kurmak için şırınga pompası Başlat
  2. Akış stabilize ve besinlerin bir grup geliştirmiştir sonra şırınga pompası akışını durdurmak ve bu noktadan itibaren kayıt süresi başlar
  3. Besin bant yanal diffüz başlar
  4. Düzenli zaman aralıklarıyla, çerçeveli dizileri kaydetmek için 'film' oluşturmak için görüntü analiz yazılımı kullanın
  5. Yüzme organizmalar, sadece hareket eden nesneleri görüntülenebilmekte, böylece, sonraki iki kare arasındaki zaman farkı fotoğraf çekmek bize hareketli olmayan parçacıklar ve arka plan gürültüsü hareketli hücreleri ayırt etmek için izin Ayırım
  6. P referans kanal hücrelerin pozisyonlarını belirlemek için film çekinbesin yama, osition
  7. 10-20 dakika süreyle düzenli aralıklarla kayıt filmler pozisyonları ve organizmaların yüzme desen analiz
  8. Farklı çerçeveler (her bir pikselin o piksel film süresi boyunca kaydedilen maksimum ışık yoğunluğu atama) organizmaların pozisyonlar üst üste görüntü analiz yazılımı kullanarak, yüzme hücreler için yörünge bilgi alabilirsiniz

Uzm # 2: bir vortexZ yüzme deniz bakteriler üzerinde kayma etkileri araştırılması

  1. Farklı kanal geometrisi kullanarak, bakterilerin farklı kayma hızı oranlarının bir girdap yüzme davranışlarını gözlemleyebilirsiniz

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deniz mikropların kendi yerel kimyasal ve fiziksel çevre ile etkileşim nasıl bir anlayış, okyanusların besin ve karbon döngüsü (Azam ve Malfatti 2007) planktonik mikroorganizma rolü daha tam ve kesin bir algı için zorunludur. Ancak, birçok önemli mikrobiyal etkileşimleri üzerinde küçük ölçeklerde (mm) nedeniyle, teknik sınırlamalar heterojen biyo-fiziko-kimyasal bir manzara içinde mikrobiyal davranışı ayrıntılı muayene engellemiştir okyanus yüzme mikropların yaşadığı tahmin. Mikroakiskan son gelişmeler (Whitesides ve ark 2001), mikrobiyal e...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MIT'de Microsystems Teknoloji Laboratuvarları Biz temiz oda tesisi bu video filmi parçası için bize izin verdiği için teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PDMS, Sylgard 184Silikon Elastomer KitiDow Corninghttp://www.ellsworth.com/sylgard.html
SU8-2100FotoresistMicroChem Corp.www.microchem.com
Nikon Eclipse TE2000-E ters mikroskopMikroskopNikon Instruments
PEEK boru (0.762 mm ID, 1.59 mm OD)AraçUpchurch Scientificwww.upchurch.com
Şırıngalar (Luer-Lok Uçlu)AraçBD Biosciences
Bağlantı Parçası P-704-01AraçUpchurch ScientificBoruyu Luer-Lok Uçlu Şırıngalara bağlamak için
Şırınga Pompası (PHD 2000 Programlanabilir)EkipmanHarvard Apparatus
CCD Kamera (PCO 1600)EkipmanCook

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).
  2. Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. Spatially explicit simulations of a microbial food web. Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).
  3. Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282, 2254-2256 (1998).
  4. Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).
  5. Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).
  6. Marcos,, Stocker, R. Microorganisms in vortices: a microfluidic setup. Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).
  7. Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. Influence of topology on bacterial social interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).
  8. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mikroak kan CihazlarBesin YamalarEpifloresan MikroskopiFaz Kontrastl MikroskopiKayma H zlarY zme DavranPDMS Ba lamaYumu ak Litografi

İlgili makaleler