Pankreas Adacıklarının Aşılanması: İn Vivo Görüntüleme için Pankreas Adacıklarını Fare Gözünün Ön Odasına İmplante Etme Yöntemi

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve jove veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir

1. Transplantasyon ekipmanı ve ameliyat masasının hazırlanması

>NOT: Tüm cerrahi aletler otoklavlanmalı, ameliyat masası ve aletler %70 alkol ile dezenfekte edilmelidir.

1. Stereotaksik bir kafa tutucuyu bir burun maskesi ile anesteziye bağlayın ve ısıtma yastığını açın.
2. Gaz geçirmez bir Hamilton şırıngasını polietilen boruya ve künt uçlu bir göz kanülüne bağlayın.
   not: Montajdan önce tüm parçaların PBS ile doldurulması tavsiye edilir. Sıkışmış hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin ve varsa çıkarın.
3. Hamilton şırıngasını masaya (Şekil 1a) veya hareketli bir tabana (Şekil 1e) sıkıca takın ve hortumu, kanül aşağı sarkacak şekilde (yani bekleme pozisyonu) stereo mikroskoba takın.
   not: Cerrahi bant kullanın, çünkü çıkarılması ve yeniden takılması kolaydır.
4. 0.1 mg / kg buprenorfin çözeltisi ile doldurulmuş 30 G'lik bir iğneye bağlı 1 mL'lik bir şırınga hazırlayın.
5. Steril PBS ile bir şırınga hazırlayın. Alternatif olarak, bir pipet kullanın.
6. Isıtma lambalı temiz bir uyandırma kafesini bir kenara koyun.

2. Ameliyat için alıcı farelerin anestezisi ve konumlandırılması

NOT: Tüm hayvanlar, Lund Üniversitesi'ndeki hayvan tesislerinde patojen içermeyen bir ortamda yetiştirildi ve bakımı yapıldı.

1. Fareyi %40 O₂/%60 N_%2/3 izofluran ile dolu bir odada uyuşturun ve uyuşturulmuş fareyi ılık bir ısıtma yastığı üzerinde baş tutucu platforma aktarın (Şekil 1a). Pedal reflekslerinin eksikliğini kontrol edin.
   not: İzofluran anestezi, ameliyat sonrası hızlı iyileşme için tercih edilen anestezi yöntemidir. İzofluran kullanmak için mikroskop odası uygun şekilde havalandırılmalıdır.
2. Farenin burnunu %40 O₂ /% 60 N₂ % 0.9 -% 1.5 izofluran anestezi makinesine bağlı anestezi maskesine yerleştirin. Başınızı ve parmağınızı kullanarak başınızı ve parmağınızı hafifçe kaldırın ve yanlardaki metal parçaları kullanarak sabitleyin. Kulaklıkların kafayı doğrudan kulakların altına sabitlediğinden emin olun. Farenin arkasına deri altına 0.1 mg / kg buprenorfin çözeltisi enjekte edin.
   not: Buprenorfin analjezik olarak kullanılır.
3. Ameliyat edilecek göz yukarı bakacak ve araştırmacıya yakın olacak şekilde başı eğin.
4. Künt forseps kullanarak nakledilecek gözün göz kapaklarını nazikçe geri çekin, gözü dışarı çıkarın ve bir cımbızla gevşek bir şekilde sabitleyin. Cımbızın uçlarının baş tutucu platformuna bağlı bir polietilen tüp ile kapatıldığından emin olun (Şekil 1a, iç kısım).
5. Göze bir damla steril PBS uygulayarak her iki gözünüzü de daima ıslak tutun.
6. İnsan adacıklarını kapalı 1.5 mL'lik tüpten (bölüm 1) steril PBS'li bir Petri kabına aktarın ve aktarılan hücre kültürü ortamı miktarını en aza indirmek için adacıkların birbirine yakın olduğundan emin olun (Şekil 1c).
7. Polietilen boru ile Hamilton şırıngasına bağlanan göz kanülünde ~ 20-30 adacık toplayın.
   not: Adacıklarla mümkün olduğunca az sıvı alın.
8. Hortumu baş aşağı asın ve stereo mikroskoba takın (Şekil 1d). Adacıkların tüpün ucuna kanüle doğru batmasını sağlamak için boruyu dikkatlice bantlayın.

>3. Transplantasyon prosedürü

NOT: Bu yöntem daha önce fare adacıklarının nakli için tanımlanmıştır. Burada biraz değiştirilmiş bir prosedür sunulmaktadır.

1. Farenin uykuda olduğundan emin olmak için pedleri arka ayaklara sıkıştırın.
2. Kan akışını bozmadan gözü kısıtlayan forsepsleri sıkın ve göze bir damla steril PBS uygulayın.
3. Neşter olarak 25 G'lik bir iğne kullanarak, yukarı doğru eğim verin, korneadaki ucun sadece yarısına dikkatlice nüfuz edin ve tek bir lateral kesi yapın. Deliği yukarı doğru bir açıyla açın; nakilden sonra delik daha kolay kapanacaktır (Şekil 1f).
4. Önceden adacıklarla yüklenmiş kanül ile korneayı dikkatlice yukarı kaldırın ve gözdeki adacıkları yavaşça uygulayın. İrisin zarar görmesini önlemek için kanülü ön kamaraya yerleştirmekten kaçının, bunun yerine kornea açıklığına dikkatlice itin (Şekil 1g). Kanülü ACE.
   'den yavaşça geri çekin not: 3-8 μL'lik bir enjeksiyon hacmi hedefleyin. Hacim çok büyükse, gözü gereksiz yere yüksek göz içi basıncına maruz bırakır ve enjekte edilen adacıkların ön kamaradan geri kaçmasına neden olabilir.
5. Göz haznesindeki artan basınç nedeniyle adacıkların yerleştirilmesinde zorluklarla karşılaştığınızda, lateral insizyon bölgesini güçlendirerek insizyon bölgesini genişletin ve adacıkları yeniden uygulayın.
   not: Bazen, tanıtılan hava kabarcıkları alan tutucu olarak kullanılabilir.
6. Göze göz jeli sürün, göz kısıtlayıcı forsepsleri gevşetin ve adacıkların sertleşmesi için fareyi 8-10 dakika aynı konumda izofluran üzerinde bırakın.
7. Göz kapağını tutan forsepsleri çıkarın ve göz kapağını normal konumuna geri koyun.
8. Fareyi baş tutucusundan çıkarın ve bir uyandırma kafesine aktarın.
9. Fare uyanık ve hareket halindeyken, orijinal kafese geri aktarın ve taramaya kadar hayvan barınağında tutun (en az 5 gün önerilir).

Resim 1: Pankreas adacıklarının gözün ön kamarasına nakli.
(a) Stereotaksik kafa tutucusuna sabitlenmiş anestezi uygulanmış fareyi ve masaya sabitlenmiş hazırlanmış Hamilton şırıngasının yanında açıkta kalan gözü (iç kısım) ve fare adacıklarını (b) veya insan adacıklarını (c) almaya hazır stereomikroskobun gösterildiği transplantasyon kurulumu. (d) Adacıklarla dolu göz kanülünün bekleme pozisyonu. (e) Nakil işlemi devam ediyor ve (f) göz kanülünün ucu ile korneayı dikkatlice kaldırmak ve ön kamaralara adacıklar dağıtmak için kullanılan tek bir lateral insizyonun şematik çizimi (g). Fare adacıklarının (h) veya insan adacıklarının (i) enjeksiyonundan hemen sonra gözün görüntüsü. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.