Organoid Elektroporasyon: Plazmid DNA'yı Gastrointestinal Organoidlere Dönüştürmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Gaebler, A. M. et al.Gastrointestinal Organoidlerin Genetik Mühendisliği için Evrensel ve Verimli Elektroporasyon Protokolü. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu videoda, pankreas duktal adenokarsinomu (PDAC), kolorektal kanser (CRC), kolanjiokarsinom (CCC) ve mide kanseri (GC) organoidleri gibi farklı antitelerde evrensel işlevselliğini kanıtlamak için büyük plazmitlerin üç boyutlu gastrointestinal organoidlere dönüştürülmesi için elektroporasyon protokolü açıklanmaktadır.

Protokol

1. Organoid Kültür ve Elektroporasyon Öncesi Preparatlar

1. Daha önce tarif edildiği gibi doku sindirimi ile organoidler oluşturun ve bunları bir bodrum matrisine genel bakışta karşılık gelen varlığa özgü kültür ortamıyla genişletin, bakınız Tablo 1 ve Malzeme Tablosu
   not: İnsan doku örnekleri için bilgilendirilmiş onam ve çalışmanın etik kurul tarafından onaylanması gereklidir.
2. Elektroporasyon sonrası tohumlama için 48 oyuklu plakaları 37 °C'de önceden ısıtın.
3. 10 μM Y-27632 ve 3 μM CHIR99021.
   dahil olmak üzere antibiyotiksiz bazal ortamın yanı sıra antibiyotiksiz varlığa özgü organoid kültür ortamı hazırlayın (bkz. Tablo 1) not: Antibiyotiklerin kesilmesi toksik etkileri azaltmak için önemlidir. Y-27632 ve CHIR99021 hücre iyileşmesini iyileştirir.
4. Organoidlerin hazırlanması (bkz. Şekil 1)
   1. Kültür ortamında elektroporasyon numunesi başına 48 oyuklu bir plakada 5 oyuklu organoid yetiştirin.
      not: Proliferatif organoidler kullanılmalıdır (son bölünmeden yaklaşık 2-3 gün sonra).
   2. Oyuk başına 10 μM Y-27632 dahil olmak üzere 230 μL ayrışma reaktifi hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
   3. Kültür ortamını her bir oyuktan çıkarın ve organoidleri hazırlanan ayrışma karışımının 230 μL'sinde mekanik olarak ayırın. Elektroporasyon numunesi başına 5 kuyuyu 15 mL'lik bir tüpte toplayın.
   4. Girdaplama ile karıştırın ve 10-15 hücrelik kümeler oluşana kadar 37 ° C'de 5-15 dakika inkübe edin. Bu nedenle, ayrışmayı mikroskobik olarak kontrol edin. 10 mL'ye kadar antibiyotiksiz bazal ortam ekleyerek sindirimi durdurun.
      not: Bu adım çok kritik! Kuluçka çok kısa olduğunda elektroporasyon verimliliği azalacak, ancak uzun sindirim hayatta kalma kabiliyetini azaltacaktır.
   5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve 4 mL elektroporasyon tamponu ile iki kez yıkayın (Malzeme Tablosuna bakınız).

2. Elektroporasyon

>NOT: Aşağıdaki protokol, kare dalgalar ve ayrılmış gözenek ve transfer darbe dizileri yapabilen elektroporatörler için geliştirilmiştir (bkz. Şekil 2). İsteğe bağlı olarak, empedans değerlerinin yanı sıra numuneye aktarılan gerilimler, akımlar ve enerjiler, tekrarlanabilir deneyler için kontrol olarak ölçülebilir.

1. Organoid peleti 30 μg plazmit DNA içeren 100 μL elektroporasyon tamponunda (Malzeme Tablosuna bakınız) yeniden süspanse edin.
   not: Elektroporasyon işlemi sırasında optimal bir tuz konsantrasyonu için kullanılan plazmit DNA'nın konsantrasyonu 5 μg/μL'yi aşmalıdır. Bu nedenle, vektörlerin hazırlanması için endofree plazmid maksi kitleri (Malzeme Tablosuna bakınız) önerilir. Sitotoksik etkiler olmadan toplam 45 μg'a kadar DNA kullanılabilir.
2. Tüm DNA-organoid karışımını, hava kabarcıkları oluşturmadan 2 mm boşluk genişliğine sahip bir elektroporasyon küvetine dağıtın.
3. Elektroporasyon parametrelerini ayarlayın (bkz. Tablo 2, Şekil 2).
4. Küvete parmağınızla vurarak hücreleri köpürmeden hafifçe karıştırın. Küveti küvet haznesine yerleştirin.
5. Elektroporatörün Ω düğmesine basın ve empedans değerini not edin.
   not: 30-40 Ω arasındaki bir empedans en iyi sonuçları gösterdi. Genel olarak 30-55 Ω aralığında olmalıdır. Aksi takdirde, lütfen aşağıdaki hususları kontrol edin: kullanılan küvetin boşluk genişliği, elektroporatörün kablo bağlantıları, olası hava kabarcıkları, elektroporasyon karışımının doğru hacmi ve tuz konsantrasyonu.
6. Elektroporasyon programını yürütmek ve görüntülenen akım, voltaj ve enerji değerlerini kontrol etmek için Başlat düğmesine basın.
   not: Ölçülen gerilimlerin, akımların ve enerjilerin değerleri, ayarlanan elektroporasyon parametrelerine karşılık gelmelidir. Tekrarlanan deneylerin karşılaştırılması için bu verileri not etmek faydalı olabilir.
7. Elektroporasyondan sonra, hemen antibiyotiksiz 500 μL kültür ortamı ekleyin (CHIR99021 ve Y-27632 ile; bkz. adım 1.3). Beyaz köpüğü ayırmak için yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
   not: Beyaz köpük, elektroporasyon işleminden sonra ortaya çıkar ve buna önemli sayıda hücre bağlanır. Bu nedenle, hücrelerin kaybedilmemesi için ayrışması çok önemlidir.
8. Elektroporasyon küvetlerine ait pipeti kullanarak numuneyi küvetten tamamen 15 mL'lik yeni bir tüpe aktarın (bkz. Malzeme Tablosu). Kalan hücreleri elde etmek için küvetin tekrar bazal ortam ile durulanması önerilir.
9. Hücrelerin yenilenmesi için, oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin.

3. Hücrelerin Tohumlanması

1. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
2. Peleti 100 μL bazal matriste yeniden süspanse edin ve önceden ısıtılmış 48 oyuklu bir plakada 20 μL'lik damlalar tohumlayın (bkz. adım 1.2). Polimerizasyon için 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin ve Y-27632 ile takviye edilen 250 μL kültür ortamı ekleyin ve büyüyen organoidlerin bir sonraki bölünmesine kadar (yaklaşık 5-7 gün) CHIR99021
.

4. Transfeksiyon Verimliliğinin Belirlenmesi

NOT: Genel olarak, ek transfeksiyon kontrolü olarak bir floresan işaretleyici taşıyan bir vektörün elektroporate edilmesi önerilir. Seçilen işaretleyiciye ve kromofor olgunlaşmasına bağlı olarak, floresan transfeksiyondan yaklaşık 24-48 saat sonra görünür olacaktır18.

1. Transfeksiyon kontrolünde 24-48 saat sonra floresansı mikroskobik olarak kontrol edin (Şekil 3B)

Tablo 1: Bazal ortamın bileşimi, sindirim karışımları ve yetiştirme ortamı.

Bazal ortam bileşenleri:	ben	ıı
Gelişmiş DMEM/F-12	-	-
Glutamax (Glutamaks)	1 katı	1 katı
Hepes Belediyesi	10 milyon	10 milyon
Penisilin Streptomisin	-	1 katı
Çuha çiçeği	1 katı	-

< td colspan="2">0.625 mg / ml < td colspan="2">2.5 mg / ml < td colspan="2">2.5 mg / ml < td colspan="2">0.1 mg / ml

Sindirim yoluyla kuruluş
Sindirim karışımı:	İki nokta üst üste		Mide		Karaciğer		Pankreas
	normal	tümörlü	normal	tümörlü	normal	tümörlü	normal	tümörlü
Kollajenaz II	-	-	-	-	-
Kollajenaz XI	-	0.1 mg / ml	-	0.1 mg / ml	-		-
Kollajenaz D	-	-	-	-	-
Dispas II	-	1 mg / ml	-	1 mg / ml	-
DNaz I	-	-	-	-	-
Edta	2 milyon	-	10 milyon	-	-		-
Seyreltilmiş	Şelatlama tamponu*	Bazal ortam I	Şelatlama tamponu*	Bazal ortam I	in EBSS		Bazal ortam I
Kuluçka için:	Buz üzerinde 0,5 saat	37°C'de 1 saat	RT'de 0.25-0.5 saat	37°C'de 1 saat	37°C'de 0,5-1 saat	37°C'de 1,5 saat	37 ° C'de 0,5-1	37°C'de 2-3 saat
Referanstan uyarlanmıştır:	Sato ve ark. 2011		Bartfeld ve ark. 2015		Broutier ve ark. 2016		Hennig ve ark. 2019

Serisi Sertifikası Serisi

Yetiştirme ortamı (Temel: Bazal ortam II)
A83-01	0,5 μM	2 μM	5 μM	0,5 μM
B27	1 katı	1 katı	1 katı	1x
A vitamini içermeyen B27	-	-	1 katı	-
Forskolin	-	-	10 μM	-
hFGF-10	-	200 ng/ml	100 ng/ml	100 ng/ml
hHGF (Türkçe)	-	-	25 ng/ml	-
[Leu15] Gastrin	10 nM	1 milyon	10 nM	10 nM
mEGF (Coğrafi Destek)	50 ng/ml	50 ng/ml	50 ng/ml	50 ng/ml
N2	-	-	1 katı	-	1 katı
N-Asetil-L-Sistein	1,25 milyon	1 milyon	1 milyon	1 mM
Nikotinamid	10 milyon	10 milyon	10 milyon	10 mM
Kafa	%10	%10	-	10 %
Çuha çiçeği	1x (100 μg/ml)	1x (100 μg/ml)	1x (100 μg/ml)	1x (100 μg/ml)
Prostaglandin E2	10 nM	-	-	-	1 μM
Rspondin (Rspondin)	20 %	%10	%10	10 %
SB202190	3μM	-	-	-
Wnt3A Serisi	50 %	50 %	-	50 %
*Şelatlama tamponu: 5.6 mM Na2HPO4, 8.0 mM KH2PO4, 96.2 mM NaCl, 1.6 mM KCl, 43.4 mM sükroz, 54.9 mM d-sorbitol, 0.5 mM dl-ditiotreitol damıtılmış suda

Sonuçlar

Şekil 1: Elektroporasyon hazırlığı iş akışı. İlk olarak, organoidler 10-15 hücreli kümelere ayrılmalı ve antibiyotikler yıkanmalıdır. Elektroporasyondan sonra beyaz köpüğün ayrışması gerekir. Hücreler, oda sıcaklığında 40 dakika yenilend...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
[Leu15] Gastrin	Sigma-Aldrich	G9145
A83-01	Tocris Biyobilim	2939
Gelişmiş DMEM/F-12	Canlandırıcı	12634010
B27	Canlandırıcı	17504044
B27 takviyesi, eksi A vitamini	Thermo Fisher Bilimsel	12587010
CHIR99021	Kök	04-2004
Kollajenaz II	Yaşam Teknolojileri	17101-015
Kollajenaz XI	Sigma-Aldrich	C9407-100MG
Kollajenaz D	Roche	11088866001
Dispas II	Roche	4942078001
Dnase I	Sigma-Aldrich	D5319
D-sorbitol	Roth	6213.1
Ditiyotreitol	Termo Bilimsel	1859330
Edta	Roth	8040
Forskolin	Tocris Biyobilim	1099
Glutamax (Glutamaks)	Yaşam Teknolojileri	35050061
Hepes Belediyesi	Thermo Fisher Bilimsel	15630106
hFGF-10	Preprotech (Teknolojik Teknoloji)	100-26
Kartal	Sigma-Aldrich	P9541 Serisi
KH2PO4	Roth	3904.2
Matrigel (Matrijel)	Corning	356231	bodrum matrisi
mEGF (Coğrafi Destek)	Canlandırıcı	PMG8043
N2	Canlandırıcı	17502048
NaCl (Doğal)	Roth	3957.1
Na2HPO4	Roth	K300.2
N-Asetil-L-Sistein	Sigma-Aldrich	A9165
Nikotinamid	Sigma-Aldrich	N0636
Kafa	N.A.	N.A.	HEK293 hücrelerinden üretilen şartlandırılmış ortam (Hek293- mNoggin-Fc)
Rekombinant İnsan HGF	Preprotech (Teknolojik Teknoloji)	100-39 Saat
Rspondin (Rspondin)	N.A.	N.A.	HEK293 hücrelerinden üretilen şartlandırılmış ortam (HA-Rspo1- Fc-293T)
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067 Serisi
TrypLE Ekspres	Gibco (Gibco)	12604021	Ayrışma reaktifi
Wnt3A Serisi	N.A.	N.A.	L-Wnt3a hücrelerinden üretilen şartlandırılmış ortam (Sylvia Boj'dan)
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503
48 oyuklu plaka	Corning	3548
Nepa Elektroporasyon Küvetleri 2 mm boşluklu ve pipetli	Nepa Gene Co., Ltd.	EC-002S
Elektroporatör Nepa21	Nepa Gene Co., Ltd.	N.A.
EVOS FL Otomatik	Canlandırıcı	AMAFD1000	Floresan mikroskobu
EndoFree Plazmid Maxi Ki	Keçi	12362
Opti-MEM	Gibco (Gibco)	31985047	Elektroporasyon tamponu
2 gRNA birleştirici vektör	Gen Ekle	84879
PX458 Plazmid	Gen Ekle	48138	sgRNA ve Cas9 için kodlama
px458_Conc2 plazmid	Gen Ekle	134449	iki farklı sgRNA için 2x U6 promotor içeren px458 plazmit

Gazetesi Serisi Serisi Sertifikası Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi (İngilizce) adet Serisi Gazetesi (İngilizce) Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi adet Serisi