1. Pankreas tümörlerinin sindirimi
- Diseke edilmiş pankreas tümörünü, metastatik bölge tümörlerini veya sağlıklı pankreas dokusunu buz gibi soğuk PBS'ye yerleştirin ve buz üzerinde saklayın.
- Tümörü bir Petri kabına aktarmak için forseps kullanın.
- 50 mL'lik bir tüpe 5.0 mL sindirim ortamı (2 mg / mL Kollajenaz, 0.025 mg / mL DNaz RPMI) ekleyin; enzim aktivitesinin başlamasını önlemek için buz üzerinde saklayın.
not: Bu protokol, ≥1 birim / mg FALGPA ve > 125 kollajen sindirim birimi (CDU) / mg katı aktiviteye sahip Kollajenaz Tip V kullanır. Kollajenaz ve DNaz alikotları -20 °C'de saklanabilir ve kullanımdan önce buz üzerinde çözülebilir. Her ikisi de steril RPM'de tamamen çözündürüldüğünde, kirleticileri gidermek için 0,2 μm'lik bir filtreden geçirilebilirler. Malzeme kaybını önlemek için kollajenaz filtrelemeden önce tamamen çözündürülmelidir.
- Petri kabındaki tümörü kaplamak için bu çözeltiden küçük bir alikot alın.
- Tümörü kabaca 3 mm'den daha kısa olan küçük parçalar halinde kesmek için steril neşter ve forseps kullanın.
- Tümör parçalarını tüpe kazıyın ve tüm parçalar sindirim ortamına batırılana kadar tüpü yavaşça ters çevirin. Diğer tümör örneklerinin toplu halde hazırlanması gerekiyorsa buz üzerinde saklayın.
- 37 °C'de 20 dakika boyunca çalkalama cihazına aktarın. Tüm tümör parçalarının suya batırıldığından ve tüpün kenarına yapışmadığından emin olun. Çalkalamak mümkün değilse, sindirime yardımcı olmak için numuneyi her 5 dakikada bir girdaplayın.
2. Sindirilmiş tümörden tek hücreli süspansiyonun hazırlanması
- Sindirim adımından hemen sonra, enzim aktivitesini yavaşlatmak için tüpü buzun üzerine yerleştirin.
- 20 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için EDTA ekleyin ve karıştırmak için numuneyi kısaca girdaplayın. Bu, enzim aktivitesini daha da yavaşlatacaktır.
- Tüpü açın ve tüpün kapağındaki herhangi bir tümör sindirimini taze RPMI ortamı ile durulayın.
- 50 mL'lik açık bir tüp üzerinde buz üzerinde 70 μm'lik bir süzgeç (süzgecin μm boyutu istenildiği gibi değiştirilebilir) hazırlayın.
- Filtreyi orta ile önceden ıslatın.
- Sindirilmiş hücreleri yeniden süspanse edin ve tüpün kenarlarını 25 mL veya daha büyük bir şerit kullanarak yıkayın. Şeridin daha geniş açılması, kalın sindirimin kolayca geçmesini sağlamak için önemlidir.
- 25 mL şerit kullanarak tüm sindirimi süzgecin üzerine aktarın.
- 1 mL'lik bir şırınga pistonu kullanarak tümörü filtrenin üstüne ezin. Hücrelere kayma stresini en aza indirmek için yalnızca doğrudan yukarı ve aşağı ezin.
- Hücreleri RPMI ile süzgeçten sürekli olarak yıkayın. Hücreleri itmek için yeterli kuvvetle yıkadığınızdan emin olun.
- Hala ezilecek malzeme varsa, ancak RPMI akmayı durdurursa, süzgeç doymuş olacaktır. Bu nedenle, numuneyi yeni bir filtreye aktarın ve devam edin.
not: Sonunda filtrede sadece hücre dışı matris bileşenleri kalacaktır, tüm tek hücrelerin geçmiş olması gerekir.
- Tüpü 300 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Hücre peletini tam RPM'de dikkatlice yeniden süspanse edin ve yeterince yeniden süspanse edilemeyen hücre dışı matrisi veya büyük hücre kümelerini çıkarmak için doğrudan başka bir filtreden geçirin.
- Bu noktada, herhangi bir stimülasyon gerekmiyorsa, plakayı 300 x g ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjlemek için atlayarak akış sitometrisi analizi için izole edilen hücreleri hemen boyayın. Tek bir keskin hareketle plakayı baş aşağı iterek süpernatanı çıkarın. Alternatif olarak, bunları donma ortamında (FBS'de %10 DMSO) yeniden süspanse edin ve -80 °C'de saklayın, ardından sıvı nitrojen içinde uzun süreli saklayın.
not: Dondurma adımı, daha sonraki bir tarihte bağışıklık hücrelerinin saflaştırılmasına izin verebilir; Bununla birlikte, bağışıklık hücresi alt kümelerinin nicelleştirilmesi, hücre sayılarının ve fenotipin donma/çözülme işleminden etkilenmediğini doğrulamak için optimizasyon gerektirebilir. Ex vivo T hücre stimülasyonu en iyi şekilde taze tümör örnekleri üzerinde gerçekleştirilir. Bu noktada numune, gerekirse boncuk bazlı ölü hücre uzaklaştırma veya bağışıklık hücresi zenginleştirme testleri ile daha fazla saflaştırılabilir.
3. Hücrelerin ex vivo stimülasyon için hazırlanması
- Tam ortamda 2 x 106/ 100 μL'lik bir konsantrasyon elde etmek için hücreleri sayın (RPMI% 10 FBS, 1X penisilin ve 1X streptomisin).
not: Kaplanan toplam hücre sayısının yüksek olması, bu numune içinde analiz etmek için yeterli T hücresi bulunmasını sağlar. Bununla birlikte, sayı, numune mevcudiyetine ve ilgilenilen T hücresi alt kümelerinin nadir doğasına bağlı olarak yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir.
- U tabanlı 96 oyuklu bir plakada 100 μL hücre plakası.
- 2x PMA/iyonomisin preparatı içeren 100 μL tam ortam ekleyin (üretici tarafından önerildiği gibi sırasıyla 0,081 μM ve 1,34 μM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için).
not: Degranülasyon / ekzositoz ölçülüyorsa, buraya ortamda floresan konjuge bir anti-fare CD107a'yı da ekleyin. CD107a içermeyen bir kontrol numunesi de yapılmalıdır.
- 1 saat boyunca% 5 CO2 içeren 37 ° C inkübatöre yerleştirin.
- 20 μL'lik 10x brefeldin A ve monensin preparatını ekleyin (tam ortamda sırasıyla 1.06 μM ve 2.0 μM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için (üretici tarafından önerildiği gibi).
not: Brefeldin A ve monensin, protein taşıma inhibitörleridir ve bu nedenle hücre dışı sitokinlerin salınmasını bloke eder, vb. akış sitometrisi ile tespit edilmelerine izin verir. ELISA veya benzer yöntemlerle süpernatana sitokin salınımı ölçülüyorsa - o zaman bu adım atlanabilir.
- Plakayı 4 saat daha% 5 CO2 içeren 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
