Pankreas Hücrelerinde Kalsiyum Dinamiklerini Görüntüleme: Pankreas Adacığındaki Sitozolik Kalsiyum Konsantrasyonundaki Gerçek Zamanlı Değişiklikleri İncelemek İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Hamilton, A., et al. Fare Pankreas Adacığı Hücrelerinin Alt Popülasyonlarında Kalsiyum Dinamiklerinin Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu videoda, pankreas adacık hücrelerinin küçük alt popülasyonlarındaki sitozolik kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikleri incelemek için adacık hücrelerinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesi tekniği açıklanmaktadır. Minör hücre alt popülasyonları, belirli bir adacık hücresi popülasyonunda sitozolik kalsiyumda değişikliklere neden olan adrenalin ve ghrelin gibi işaretleyici bileşiklere fonksiyonel tepkiler kullanılarak tanımlanabilir. Bu, kan şekeri ile adacık salgısı çıktısı arasındaki çapraz konuşma hakkında bir fikir verebilir.

Protokol

1. Boyayı yükleyin veya sensörü ifade edin

1. Katlanabilir boyayı hazırlayın.
   1. Alınabilir boyanın (örneğin, Fluo-4) alikotunu (normalde 50 μg) DMSO'da 2 mM'lik bir stok konsantrasyonuna çözün. Boyanın çözünmesini iyileştirmek için% 1'lik bir nihai konsantrasyona (DMSO'da% 20'lik bir stok kullanarak) pluronik asit ekleyin.
   2. Boyayı küçük PCR tüplerinde (her birine 2 μL) alikotlayın. Boya birkaç hafta boyunca donmuş olarak (-20 °C) saklanabilir.
2. Alternatif olarak, rekombinant sensörü hazırlayın.
   1. Sensörü (örn. GCaMP6f kodlayan adenoviral vektör) 10 μL'lik alikotlara dağıtın ve -80 °C'de saklayın.
   2. (İsteğe bağlı olarak), enfeksiyon için en uygun konsantrasyonu ortaya çıkarmak için birkaç seri seyreltme kullanarak adacıkları (aşağıdaki gibi) enfekte ederek viral stokun titresini önceden test edin.
      not: Farklı vektörler (lentivirus, BacMam, AAV) tarafından kodlanan rekombinant sensörler farklı bir enfeksiyon protokolü gerektirir. Bunu vektör sağlayıcı ile kontrol ettiğinizden ve çalışma oranını ihtiyaçlarınıza göre optimize ettiğinizden emin olun. Adenovirüsün "çalışan" stoğu -20 °C'de saklanabilir ve birkaç kez dondurulabilir/çözülebilir. Aşırı donma-çözülme döngüsü, virüsün etkili titresini azaltır.
3. Görüntüleme solüsyonunu hazırlayın.
   1. Görüntüleme solüsyonunu oluşturun, mM: 140 NaCl, 4.6 KCl, 2.6 CaCl₂, 1.2 MgCl₂, 1 NaH₂PO₄, 5 NaHCO₃, 10 HEPES (pH 7.4, NaOH ile).
   2. Görüntüleme solüsyonunda bir glikoz (0,5 M) ve mannitol (0,5 M) stoğu oluşturun. Stok buzdolabında (4 °C) birkaç hafta saklanabilir.
4. Katlanabilir boyayı yükleyin.
   1. 6 mM glikoz içeren görüntüleme solüsyonunun 600 μL'sinde boyanın 2 μL'sini çözerek boya çalışma solüsyonunu oluşturun. Çözelti, çözünürlüğü iyileştirmek için ısıtılabilir veya girdaplanabilir.
   2. İzole edilmiş adacıkları boyanın çalışma çözeltisine yükleyin. Yükleme, çok kuyulu bir plaka veya bir Petri kabı kullanılarak yapılabilir. İkinci durumda, yapışkan olmayan bir Petri kabının (35 veya 60 mm) dibine 100 μL'lik bir çalışma çözeltisi damlatın ve damlacığın içine 10-30 adacık pipetleyin.
   3. Farklı adacık grupları olması durumunda (örn. vahşi tip/nakavt), yüklemenin aynı anda yapılabilmesi için birden fazla kuyu ve birden fazla damlacık düzenleyin.
   4. Boya işleme çözeltisindeki adacıkları oda sıcaklığında karanlıkta 70-90 dakika inkübe edin. Aşırı kuluçka yapmayın.
   5. Floresan mikroskobu altında yüklemeyi kontrol edin; adacıklar hafif floresan kazanmalı, bazı hücreler diğerlerinden daha parlak olmalıdır. Hücrelerin toplanması ve boyanın nükleer lokalizasyonu aşırı yüklenmenin belirtileridir.
   6. Adacıkları 6 mM glikoz içeren boyasız görüntüleme solüsyonuna aktarın. Adacıklar hemen görüntüleme için kullanılabilir, ancak isteğe bağlı olarak boya 10-15 dakika daha esterden arındırılmaya bırakılabilir. Adacıklar boyayı birkaç saat boyunca koruyacaktır ve bu nedenle birkaç vardiyada görüntüleme için kullanılabilir.
5. Alternatif olarak, adacıkları rekombinant vektör ile enfekte edin.
   1. Adacıkları, %10 fetal buzağı serumu, 100 ünite / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin ile desteklenmiş RPMI kültür ortamında (RMPI1640 damlacıklar halinde kaplayın (Malzeme Tablosuna bakınız). Ortamı iki adet 60 mm'lik plastik Petri kabına (herhangi bir yapıştırıcı ile işlem görmemiş) dağıtın ve bulaşıkları inkübatörde tutun (37 °C, %5 CO₂, mutlak nem)). (örneğin, 30 μL), gereken vektör hacmini en aza indirmek için.
   2. Vektörü, ideal olarak enfeksiyon >2'nin çokluğuyla sonuçlanması gereken yaklaşık 10⁵ bulaşıcı birim / adacık oranında ekleyin. İdeal olarak, oran, çevresel katmanda ifade sağlayacak minimum orana optimize edilmelidir. Ön titrasyon (adım 1.2.2) yardımcı olabilir.
   3. Damlacığa 20-50 adacık ekleyin ve 8-48 saat boyunca kültürleyin. (İdeal olarak, bir gecede). Adacıklar, hücre morfolojisinde değişiklik olmaksızın hücrelerin çoğunda soluk yeşil bir floresan geliştirmelidir.
      not: Enfeksiyonun ve ekspresyonun başarısı, virüs çözeltisine maruz kalma süresine bağlıdır. İdeal olarak, virüs gece boyunca çözelti içinde kalmalıdır, ancak isteğe bağlı olarak 15 dakika kadar kısa bir süre sonra çıkarılabilir. Bununla birlikte, bulaşıcılık ve dolayısıyla ekspresyonun önemli ölçüde daha düşük olması muhtemeldir.

2. Görüntüleme Ca²⁺ dinamikleri

1. Adacıkları (ters çevrilmiş) mikroskop altında hareketsiz hale getirin.
   1. Ters mikroskopi için görüntüleme odasını monte edin. Cam lamel (kalınlık 1 veya 1.5) haznenin içine yerleştirin ve cam hazne arayüzünün su geçirmez olduğundan emin olun. Lamelin mikroskop objektifinin ulaşabileceği bir yerde olup olmadığını kontrol edin (hantal yüksek NA objektifi için kritiktir).
   2. İmmobilizasyon aksesuarlarını hazırlayın. İnce ağdan ve kaba ağdan küçük dikdörtgenler (20 mm x 20 mm) kesin. 45-50 μm kalınlığında bir yapışkan bant kullanarak ince ağ üzerine iki ara parça "duvar" yerleştirin. Görüntülenecek adacıkların boyutu geleneksel 100 μm'yi önemli ölçüde aşıyorsa, ara parçanın çift katmanını kullanın.
   3. Ağları ve ağırlığı 35 mm'lik bir Petri kabı kullanarak görüntüleme solüsyonuna daldırın. Plastiğin ve metalin ıslak olduğundan emin olun.
   4. Bir diseksiyon mikroskobu altında, ara parça "duvarları" baş aşağı, ara parçalar yukarı bakacak şekilde ince ağı çevirin. Çekilebilir boya yüklü veya rekombinant sensörü bir P20 pipeti ile ifade eden birkaç adacık seçin ve bunları iki ara parça arasındaki ince ağın üzerine nazikçe yerleştirin. Ağ ve rondelaların üzerlerinde aşırı miktarda görüntüleme solüsyonu içermediğinden emin olun.
   5. Saatçinin forsepslerini kullanarak adacıkların bulunduğu ağı kaldırın ve ara parçalar aşağı bakacak ve doğrudan oda lamelinin üzerine oturacak şekilde görüntüleme odasının içinde baş aşağı konumlandırın. Adacıkların, lamel ortasında, ara parçalar ile ağ arasında sıkıştığından emin olun.
   6. Kaba ağı ve ağırlığı, hazne içindeki ince ağın üzerine yerleştirin. Görüntüleme solüsyonunu hazneye yerleştirin. Adacıkların hareketsiz hale getirildiğinden ve görüntülenmeye hazır olduğundan emin olun. Haznenin aşırı sallanmasından kaçının (hazneyi mikroskoba taşımak ve ısıtılmış bir aşamaya yerleştirmek gibi küçük bozulmalar kabul edilebilir).
      not: Benzer bir immobilizasyon düzenlemesi dik bir sistem için de uygulanabilir.
2. Mikroskobu kurun.
   1. Görüntüleme modunu ve hedefi seçin, odayı adım 2.1'deki adacıklarla birlikte mikroskobun sıcaklık kontrollü aşamasına yerleştirin.
      1. Sıcaklık kontrolünü (ideal olarak 30 °C ile 36 °C arasında) ve perfüzyonu ayarlayın. Ters çevrilmiş bir sistem için, girişi hazne içindeki çıkıştan daha düşük konumlandırın ve çıkış akışını girişten daha büyük olacak şekilde ayarlayın (bu tipik olarak peristaltik bir pompada daha geniş bir iç çapa sahip bir boru kullanılarak elde edilir).
      2. Dış akışın çözelti ile minimum temas yüzeyine sahip olduğundan emin olun, böylece çözeltiyi birden fazla ardışık küçük damlacıklar halinde çıkarır ve uzun aralıklarla sürekli çözelti çıkarmadan kaçınır. Sonuncusu, görüntülenen her pikselin düzenli periyodik yoğunluk salınımları olarak göründükleri ve sıklıkla "yavaş dalgalar" olarak yorumlandıkları için periyodik sinyallerin hızlandırılmış görüntülemesinde ana artefakt kaynağıdır.
      3. 3 mM glikoz içeren görüntüleme solüsyonu ile perfüzyonu başlatın.
   2. Yeşil floroforların görüntülenmesi için ışık yolunu ve filtreleri seçin; 470 ile 500 arasında uyarma ve 505 ile 550 arasında emisyon her biri için işe yarayacaktır.
   3. Görüntüleme parametrelerini ayarlamak için canlı görüntülemeyi çalıştırın. İlgilenilen adacıkları yakalamak için görünümü ayarlayın.
   4. Görüntünün sinyal-gürültü oranını optimize edin. Bu amaçla, uyarma ışığı yoğunluğunu, pozlama süresini ve gruplamayı ayarlayın. Ayarların, adacık içindeki her hücrenin mümkün olan en düşük ışık yoğunluğu ve maruziyetinde farklı bir şekilde görselleştirilmesine izin verdiğinden emin olun.
   5. Görüntü alımını gerçekleştirin. Göreve bağlı olarak, görüntüler 0,1 ila 5 Hz'de çekilebilir. Bu, α ve δ hücrelerde (>300 Hz) hızlı Na⁺ güdümlü salınımlar için Nyquist kriterlerinin oldukça altındadır, bu da verilerin varsayılan olarak yetersiz örneklendiği anlamına gelir. Bununla birlikte, bu talebi karşılamak için çekim sıklığını artırmak, geniş bir görüş alanına sahip çok hücreli/çok adacıklı görüntülemede mümkün değildir. GCaMP daha hızlı görüntülenebilirken, Fluo4 hızlı alım koşulları altında kaçınılmaz olarak ağartıcı olacaktır.
      not: Adacık hücrelerindeki [Ca^{2 +}] _sit salınımlarının elektriksel aktivite tarafından yönlendirildiği göz önüne alındığında, düşük edinim oranlarının kullanılması ters etki yapabilir. Bununla birlikte, gerçekte, 1 Hz civarında veya üzerindeki edinme oranları, β hücreli ani yükselme davranışını çözmek için yeterli olabilirken, α ve δ hücrelerde sodyum kanalı güdümlü salınımların tespiti için eşik 300 Hz'nin oldukça üzerindedir. α veya δ hücreli [Ca^{2 +}] _sit salınımları 1 Hz veya 0.1 Hz'de elde edilse de, ciddi şekilde yetersiz örneklenecek ve elektriksel aktiviteden ziyade hücre tarafından Ca^{2 +} işlemesini yansıtacaktır.
      1. Elde edilen verilerin kalitesini kontrol edin: 3 mM glikozda, α hücre aktivitesi açıkça görülebilir / tespit edilebilir olmalıdır. Durumun böyle olduğundan emin olun ve tam ölçekli hızlandırılmış görüntülemeye geçin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
40x/1.3 objektif
GCaMP6f, (insan tipi 5) adenoviral vektör	Vektör Biyolaboratuvarları	1910
Fetal sığır serumu	Sigma-Aldrich	F7524-500ML
RPMI ortamı	Thermo Fisher (GibCo, Yaşam Teknolojileri)	61870044
Penisilin / Streptomisin	Thermo Fisher (GibCo, Yaşam Teknolojileri)	15140122
Axiovert 200 mikroskobu
Fluo4	Thermo Fisher (Yaşam Teknolojileri)	F14201