Primer Acinar Hücre İzolasyonu: Acinar Hücreleri Fare Pankreasından İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Fleming Martinez, A. K., et al. 3 Boyutlu Hücre Kültüründe Pankreas Acinar-to-Duktal Metaplazisini Taklit Etme ve Manipüle Etme. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu videoda, çeşitli sindirim enzimleri içeren pankreas asiner hücrelerini (ekzokrin hücreler) izole etmek için kullanılan teknik açıklanmaktadır. Primer asiner hücreler, pankreas kanseri gelişiminde erken bir olay olan asinar-duktal metaplazinin (ADM) ex vivo çalışmasında faydalıdır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve jove veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Acinar Hücre İzolasyonu

1. Fareyi CO₂ indüksiyonu ile feda edin ve servikal çıkık gerçekleştirin. Hemen pankreası diseksiyon edin. Pankreası incelemek için önce farenin pençelerini polistiren kapağa sabitleyin, fareyi kuyruğu araştırmacıya bakacak şekilde yönlendirin ve karına% 70 etanol püskürtün.
   not: Temsili sonuçlarda kullanılan fare, C57BL / 6 arka planına sahip 12 haftalık transgenik olmayan bir dişiydi. Fare seçimi, tartışma bölümünde daha ayrıntılı olarak tartışılmaktadır.
   1. Bir dizi otoklavlanmış makas ve forseps kullanarak, forseps orta hatta olacak şekilde kürkü/deriyi kaldırın ve makası, üretral açıklıktan diyafram/göğüs kafesi bölgesine kürk ve deriden bir kesi yapmak için kullanın.
   2. Karın boşluğunun net bir görünümünü oluşturmak için kürk/deri kesilecek şekilde sola ve sağa ek kesiler yapın. Daha sonra, peritoneal astarı kesin (ortadan aşağıya ve sağa ve sola) ve kürk / deri ile yapıldığı gibi organlardan uzaklaştırın.
   3. Bağırsakları forseps ile kaldırın ve farenin sol tarafına koyun, açık pembe renkli pankreası görmek için alan yaratın ve koyu kırmızı bir oval olan dalağa yapışık. Pankreas dokusu yumuşak, süngerimsi dokusu ile ayırt edilir. Mide boyunca uzanacak ve bağırsaklarla iç içe geçecek olan pankreası kesin.
   4. Dalağı pankreastan ayırın. Daha sonra pankreası 1x penisilin-streptomisin içeren 10 mL HBSS içeren 50 mL'lik bir tüpe koyun ve bunu laminer akış başlığına getirin.
      not: Protokolün geri kalan adımları, laminer akış başlığında steril teknik kullanılarak yapılmalıdır.
2. Pankreas ve HBSS'yi (penisilin-streptomisin ile) boş bir tartı teknesine dökün ve forseps kullanarak pankreası döndürerek yıkayın. Daha sonra pankreası forseps ile HBSS (penisilin-streptomisin ile) içeren ikinci bir tartı teknesine taşıyın. Yine pankreası döndürerek yıkayın.
3. Pankreası üçüncü HBSS (penisilin-streptomisin ile) içeren tartı botuna taşıyın ve pankreası 5 mm veya daha küçük parçalar halinde kesmeye başlayın. Daha sonra, pankreas parçalarını ve HBSS'yi 50 mL'lik boş bir tüpe dökün.
   1. Bunu yapmak için, tartı teknesi devrilirken pankreas parçalarını sıvının içine hareket ettirmek için forsepsleri kullanın. Tüm parçalar artık tartı teknesine bağlı olmadığında dökün. Kalan parçaları forseps ile toplayın ve forsepsleri HBSS'de pankreası içeren 50 mL'lik tüpte penisilin-streptomisin ile yıkayın.
4. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 931 x g'da santrifüjleyin ve ardından HBSS'yi (ve yüzen yağları) 5 mL'lik bir pipetle pipetleyerek çıkarın.
5. 5 mL kollajenaz ekleyin (HBSS'de 40 mL HBSS +% 5 FBS, 20 mL HBSS +% 30 FBS ve 5 mL 2 mg / mL kollajenaz yapın. Kollajenazı süzülerek (0.22 μm gözenek) sterilize edin ve oda sıcaklığında tutun. HBSS solüsyonlarının her birini buz üzerinde tutun) pankreasa kadar. 50 mL'lik tüpü plastik parafin filme sararak kapalı bir kapak sağlayın ve ardından 37 ° C'de 20 dakika boyunca 220 rpm'de sallayarak bir inkübatöre yerleştirin.
   not: Kollajenaz sindirim süresi, tartışmada belirtildiği gibi değişebilir. Kuluçka sonunda büyük bir doku parçası kalmamalıdır.
6. Ayrışmayı durdurmak için pankreas içeren tüpü buzun üzerine yerleştirin ve 5 mL soğuk HBSS +% 5 FBS ekleyin. 4 °C'de 2 dakika boyunca 931 x g'da santrifüjleyin ve ardından 5 mL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı pipetleyin.
7. 10 mL HBSS +% 5 FBS'de yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de 2 dakika boyunca 931 x g'da santrifüjleyin. 5 mL'lik bir pipet kullanarak süpernatantı pipetleyin ve bu adımı başka bir 10 mL HBSS +% 5 FBS ile tekrarlayın.
8. 5 mL HBSS +% 5 FBS'de yeniden süspanse edin ve bir P1000 kullanarak, bir seferde 1 mL'yi 500 μm'lik bir ağdan 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Kalan pankreas hücrelerini ağ boyunca yıkamak için bir P1000 ile ağ boyunca ek 5 mL HBSS +% 5 FBS ekleyin.
9. Bir P1000 kullanarak bir seferde 1 mL pipetleyerek hücre süspansiyonunu 500 μm ağdan 105 μm ağdan geçirin. Ardından, hücre süspansiyonunu HBSS +% 30 FBS içeren bir tüpe nazikçe pipetleyin. Üstte bir hücre süspansiyonu tabakası oluşacaktır; Santrifüjleme üzerine, asiner hücreler bir pelet oluşturmak için batacaktır.
10. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 233 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti 1x Waymouth'un tam ortamında yeniden süspanse edin.
    1. Hücrelerin doğrudan kollajen veya bazal membran matrisine gömülmesine geçiliyorsa, pankreas başına 7 mL'lik bir hacimde yeniden süspansiyon haline getirin. Adenoviral veya lentiviral enfeksiyona devam ediyorsanız, pankreas başına 4 mL'de yeniden süspansiyon
    haline getirin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
37 °C çalkalamalı inkübatör	Termo Bilimsel	SHKE4000-7
%5 CO2, 37 °C İnkübatör	NUAIRE BELEDIYESI	NU-5500 Serisi
50 ml'lik tüpler	doğan	352070
Emici ped, 20" x 24"	Balıkçı markası	1420662
BD Hassas Kayma İğnesi 21G x 1/2	Balıkçı Bilimsel	305167	Diseksiyon için pim olarak kullanın
Beher, 600 mL	Balıkçı markası	FB-101-600
merkezkaç	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	Allegra X-15R Santrifüj
Kollajenaz Tip I, Clostridium histolyticum	Sigma	C0130-1G	Tozu steril moleküler biyoloji dereceli suda çözerek 100 mg / ml'lik bir çözelti oluşturun. Bir alikotu çözdürürken, 10 mg / ml'ye seyreltin, süzerek sterilize edin ve -20 ° C'de 1 ml alikot yerleştirin.
Deksametazon	Sigma	D1756	Tozu metanol içinde çözerek, alikot ederek ve -20 ° C'de saklayarak 4 mg / ml'lik bir çözelti oluşturun.
Etanol, 200 kanıt	Decon Laboratuvarları	2701
Fetal Sığır Serumu	Sigma	F0926-100 milyon
Forseps	Güzel Bilim Araçları	11002-12
Forseps	Güzel Bilim Araçları	91127-12
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), Kalsiyum yok, Magnezyum yok, fenol kırmızısı yok	Balıkçı Bilimsel	SH3048801
Buz kovası, dikdörtgen	Balıkçı Bilimsel	07-210-103
LAB GUARD numune torbaları (diseksiyon sonrası fare için)	Mini kavrama	SBL2X69S
Parafilm Filmi	Bemis	PM992	El yazmasında 'plastik parafin filmi' olarak anılmaktadır
Pbs	Balıkçı Bilimsel	SH30028.02
Penisilin-Streptomisin	ThermoFisher Bilimsel	15140122
Pipet uçları, 10 μl	ABD Bilimsel	1110-3700
Pipet uçları, 1000 μl	Olympus Plastik	24-165RL
Pipet uçları, 200 μl	ABD Bilimsel	1111-1700
Pipet Yardımı	Drummond
PIPETMAN Klasik P10, 1-10 μl	Gilson	F144802
PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl	Gilson	F123602
PIPETMAN Klasik P20, 2-20 μl	Gilson	F123600
PIPETMAN Klasik P200, 20-200 μl	Gilson	F123601
Pipetler, 10 ml	doğan	357551
Pipetler, 25 ml	doğan	357525
Pipetler, 5 ml	doğan	357543
Polipropilen Ağ, 105 μm	Spektrum Laboratuvarları	146436
Polipropilen Ağ, 500 μm	Spektrum Laboratuvarları	146418
makas	Güzel Bilim Araçları	14568-12
makas	Güzel Bilim Araçları	14568-13
Sodyum Bikarbonat (İnce Beyaz Toz)	Balıkçı Bilimsel	BP328-500
Sodyum Hidroksit	Balıkçı Bilimsel	S318-500 Serisi
Soya Fasulyesi Tripsin İnhibitörü	Gibco (Gibco)	17075029
spatula	Balıkçı markası	21-401-10
Steriflip 50 ml, 0.22 mikron filtreler	Kırlangıç	SCGP00525
Tip I Sıçan Kuyruğu Kollajeni	Corning	354236
Waymouth MB 752/1 Orta (toz)	Sigma	W1625-10X1L
Tekne tartısı, altıgen, orta	Balıkçı markası	02-202-101