Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Malzemelerin, Çözeltilerin ve 3 Boyutlu Matris Tabanlarının Hazırlanması
- 500 μm ve 105 μm polipropilen ağları 76 mm'ye 76 mm'lik kareler halinde kesin. Daha küçük bir katlanmış kare oluşturmak için her kareyi iki kez ikiye katlayın. Bir adet 500 μm ve bir adet 105 μm gözenekli kareyi otoklavlanabilir bir poşete yerleştirin.
- Otoklav polipropilen örgü karelerin yanı sıra iki çift makas ve forseps.
- 100 mL 10x Waymouth solüsyonu yapın. 1 şişe (14 g) Waymouth tozunu 50 mL deiyonize (DI) suya karıştırın ve çözündüğünde 30 mL %7,5 (75 g/L) sodyum bikarbonat ekleyin. DI su kullanarak son hacmi 100 mL'ye getirin ve filtre sterilize edin.
- 10 adet Waymouth ortamını 4 °C'de saklayın ve kolajen jelleri ve 1 adet Waymouth ortamını hazırlamak için kullanın. Çökeltiler oluştuğunda, atın.
- 125 μL 40 mg / mL soya fasulyesi tripsin inhibitörü, 12.5 μL 4 mg / mL deksametazon ve 500 μL fetal sığır serumu (FBS) ekleyerek pankreas başına 50 mL 1x Waymouth'un tam ortamını yapın. Süzülerek sterilize edin ve 48 saat içinde kullanın.
- Kollajen veya bazal membran matrisi kullanarak 3 boyutlu matris tabanları hazırlayın (ürün bilgileri için Malzeme Tablosuna bakın). Tabanı pipetlerken, plakayı buzun üzerine yerleştirin, kabarcıklardan kaçının ve tam kapsama sağlamak için her bir kuyucuğun hacmini pipetledikten hemen sonra plakayı döndürün.
- Aşağıdaki bileşenleri bir doku kültürü başlığında buz üzerinde karıştırarak kollajen bazları oluşturun: 5.5 mL tip I sıçan kuyruğu kollajeni, 550 μL 10x Waymouth's Media ve 366.6 μL 0.34 M NaOH (filtrelenmiş).
NOT: Bu, 24 oyuklu, 12 oyuklu veya 6 oyuklu bir plaka için kollajen bazları yapmak için yeterli çözümdür. Bir pankreastan asiner izolasyon için bir plak yeterlidir.
- Kollajen bazını kaplamak için aşağıdaki hacimleri kullanın: 80 μL (8 oyuklu cam slayt), 200 μL (24 oyuklu plaka), 400 μL (12 oyuklu plaka) veya 800 μL (6 oyuklu plaka).
- Bodrum membran matris tabanları için, matrisi herhangi bir ek bileşen olmadan pipetleyin. Her kuyucuk için aşağıdaki hacimleri kullanın: 50 μL (8 oyuklu cam slayt), 120 μL (24 oyuklu plaka), 240 μL (12 oyuklu plaka) veya 600 μL (6 oyuklu plaka).
- Bazların üzerine gömülü hücreler içeren ikinci bir matris tabakası oluşturmadan önce bazların bir hücre kültürü inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO2) en az 30 dakika katılaşmasına izin verin.
- Asiner izolasyona hazırlanırken, bir adet 600 mL'lik beher, üç adet 50 mL'lik tüp, otoklavlanmış bir makas, otoklavlanmış bir çift forseps ve üç tartı teknesi ile kaputun altında bir buz kovası bulundurun. Daha sonra, 300 μL 100x penisilin-streptomisin ile 30 mL HBSS yapın, iki tartı teknesinin her birine 10 mL koyun ve son 10 mL'yi 50 mL'lik bir tüpte tutun (1.8.2 ve 2.1.4 adımlarında kullanım için).
- HBSS'de 40 mL HBSS +% 5 FBS, 20 mL HBSS +% 30 FBS ve 5 mL 2 mg / mL kollajenaz yapın. Kollajenazı süzülerek (0.22 μm gözenek) sterilize edin ve oda sıcaklığında tutun. HBSS çözeltilerinin her birini buz üzerinde tutun.
- Bir laboratuvar tezgahında yapılabilecek pankreas diseksiyonu için bir çalışma alanı oluşturun.
- Folyo ile kaplı bir polistiren kapakla birlikte masanın üzerine emici bir ped yerleştirin. Ardından folyonun üzerine 4 iğneli bir kağıt havlu yerleştirin.
- Aşağıdaki öğeleri diseksiyon çalışma alanının erişebileceği bir yerde tutun: bir yakma torbası, bir set otoklavlanmış makas ve forseps,% 70 etanol içeren bir sprey şişesi ve bir buz kovası (adım 1.6'dan itibaren penisilin-streptomisin içeren 50 mL HBSS tüpü ile).
- Bir santrifüjü 4 °C'ye ve bir çalkalayıcıyı 37 °C'ye ayarlayın.
2. Acinar Hücre İzolasyonu
- Fareyi CO2 indüksiyonu ile feda edin ve servikal çıkık gerçekleştirin. Hemen pankreası diseksiyon edin. Pankreası incelemek için önce farenin pençelerini polistiren kapağa sabitleyin, fareyi kuyruğu araştırmacıya bakacak şekilde yönlendirin ve karına% 70 etanol püskürtün.
NOT: Temsili sonuçlarda kullanılan fare, C57BL / 6 arka planına sahip 12 haftalık transgenik olmayan bir kadındı. Fare seçimi, tartışma bölümünde daha ayrıntılı olarak tartışılmaktadır.
- Bir dizi otoklavlanmış makas ve forseps kullanarak, forseps orta hatta olacak şekilde kürkü/deriyi kaldırın ve makası, üretral açıklıktan diyafram/göğüs kafesi bölgesine kürk ve deriden bir kesi yapmak için kullanın.
- Karın boşluğunun net bir görünümünü oluşturmak için kürk/deri kesilecek şekilde sola ve sağa ek kesiler yapın. Daha sonra, peritoneal astarı kesin (ortadan aşağıya ve sağa ve sola) ve kürk / deri ile yapıldığı gibi organlardan uzaklaştırın.
- Bağırsakları forseps ile kaldırın ve farenin sol tarafına koyun, açık pembe renkli pankreası görmek için alan yaratın ve koyu kırmızı bir oval olan dalağa yapışık. Pankreas dokusu yumuşak, süngerimsi dokusu ile ayırt edilir. Mide boyunca uzanacak ve bağırsaklarla iç içe geçecek olan pankreası kesin.
- Dalağı pankreastan ayırın. Daha sonra pankreası 1x penisilin-streptomisin içeren 10 mL HBSS içeren 50 mL'lik bir tüpe koyun ve bunu laminer akış başlığına getirin.
not: Protokolün geri kalan adımları, laminer akış başlığında steril teknik kullanılarak yapılmalıdır.
- Pankreas ve HBSS'yi (penisilin-streptomisin ile) boş bir tartı teknesine dökün ve forseps kullanarak pankreası döndürerek yıkayın. Daha sonra pankreası forseps ile HBSS (penisilin-streptomisin ile) içeren ikinci bir tartı teknesine taşıyın. Yine pankreası döndürerek yıkayın.
- Pankreası üçüncü HBSS (penisilin-streptomisin ile) içeren tartı botuna taşıyın ve pankreası 5 mm veya daha küçük parçalar halinde kesmeye başlayın. Daha sonra, pankreas parçalarını ve HBSS'yi 50 mL'lik boş bir tüpe dökün.
- Bunu yapmak için, tartı teknesi devrilirken pankreas parçalarını sıvının içine hareket ettirmek için forsepsleri kullanın. Tüm parçalar artık tartı teknesine bağlı olmadığında dökün. Kalan parçaları forseps ile toplayın ve forsepsleri HBSS'de pankreası içeren 50 mL'lik tüpte penisilin-streptomisin ile yıkayın.
- 4 ° C'de 2 dakika boyunca 931 x g'da santrifüjleyin ve ardından HBSS'yi (ve yüzen yağları) 5 mL'lik bir pipetle pipetleyerek çıkarın.
- Pankreasa 5 mL kollajenaz (adım 1.7'de HBSS'de seyreltilmiş) ekleyin. 50 mL'lik tüpü plastik parafin filme sararak kapalı bir kapak sağlayın ve ardından 37 ° C'de 20 dakika boyunca 220 rpm'de sallayarak bir inkübatöre yerleştirin.
NOT: Kollajenaz sindirim süresi, tartışmada belirtildiği gibi değişebilir. Kuluçka sonunda büyük bir doku parçası kalmamalıdır.
- Ayrışmayı durdurmak için pankreas içeren tüpü buzun üzerine yerleştirin ve 5 mL soğuk HBSS +% 5 FBS ekleyin. 4 °C'de 2 dakika boyunca 931 x g'da santrifüjleyin ve ardından 5 mL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı pipetleyin.
- 10 mL HBSS +% 5 FBS'de yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de 2 dakika boyunca 931 x g'da santrifüjleyin. 5 mL'lik bir pipet kullanarak süpernatantı pipetleyin ve bu adımı başka bir 10 mL HBSS +% 5 FBS ile tekrarlayın.
- 5 mL HBSS +% 5 FBS'de yeniden süspanse edin ve bir P1000 kullanarak, bir seferde 1 mL'yi 500 μm'lik bir ağdan 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Kalan pankreas hücrelerini ağ boyunca yıkamak için bir P1000 ile ağ boyunca ek 5 mL HBSS +% 5 FBS ekleyin.
- Bir P1000 kullanarak bir seferde 1 mL pipetleyerek hücre süspansiyonunu 500 μm ağdan 105 μm ağdan geçirin. Ardından, hücre süspansiyonunu HBSS +% 30 FBS içeren bir tüpe nazikçe pipetleyin. Üstte bir hücre süspansiyonu tabakası oluşacaktır; Santrifüjleme üzerine, asiner hücreler bir pelet oluşturmak için batacaktır.
- 4 ° C'de 2 dakika boyunca 233 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti 1x Waymouth'un tam ortamında yeniden süspanse edin.
- Hücrelerin doğrudan kollajen veya bazal membran matrisine gömülmesine geçiliyorsa, pankreas başına 7 mL'lik bir hacimde yeniden süspansiyon haline getirin. Adenoviral veya lentiviral enfeksiyona devam ediyorsanız, pankreas başına 4 mL'de yeniden süspansiyon
haline getirin.
3. Viral Enfeksiyon
- İki viral enfeksiyon için bir pankreas yeterli olduğundan (kontrol ve deneysel, örneğin, null ve cre), hücre süspansiyonunu iki 35 mm'lik plakanın kapakları arasında bölün. Plakaların kapağının kullanılması, süspansiyonda enfeksiyona ve dolayısıyla daha sonra nihai alt tabakaya kolay harekete izin verir.
- Virüsle çalışırken, kullanılmış tüm pipet uçlarını en az 15 dakika boyunca %10'luk çamaşır suyunda bekletin.
not: 35 mm'lik plakaların ve 4 mL hacmin kullanılması, 8 ila 16 haftalık transgenik olmayan farelerden alınan hücreler için iyi çalışır. Daha küçük veya daha büyük pankreası olan hayvanlar için plaka boyutu ve hacminin ayarlanması gerekebilir.
- Adenoviral enfeksiyon için, virüsü (en az 107 TU / mL'lik bir titre ile) her plakanın kapağına 1: 1.000 seyreltmede ekleyin ve döndürün (Şekil 1, GFP adenovirüsü). Plakaları bir hücre kültürü inkübatörüne (37 °C,% 5 CO2) yerleştirin ve 1 saat boyunca her 15 dakikada bir döndürün. İnkübasyona 2 saat daha devam edin ve ardından hücrelerin kollajen veya bazal membran matrisine gömülmesine devam edin.
- Davlumbazdaki viral çalışmayı tamamladıktan sonra, davlumbazdaki tüm bileşenleri %10 çamaşır suyu ile en az 15 dakika ıslatın ve ardından ağartıcıyı %70 etanol kullanarak iyice temizleyin.
4. Hücrelerin Kollajen veya Bazal Membran Matrisine gömülmesi
- 7 mL tip I sıçan kuyruğu kollajeni (3.3 mg / mL), 700 μL 10x Waymouth ortamı ve 466.6 μL 0.34 M NaOH'yi birleştirerek buz üzerinde kollajen jeli yapın.
- Eşit hacimlerde kollajen jeli ve hücre süspansiyonu alarak yavaşça karıştırın. Bir uyaran veya inhibitör ekliyorsanız, bunu kollajen hücresi süspansiyonu ile birleştirin. Her seferinde bir kuyucuk plaka (adım 1.5.3'teki plakalar); Plakayı buz üzerinde tutarak, kollajen hücre tabakasını eşit şekilde dağıtmak için döndürün.
- Her bir oyukta, aşağıdaki hacimlerde kollajen hücresi süspansiyonunu pipetleyin: 200 μL (8 oyuklu cam slayt), 500 μL (24 oyuklu plaka), 1000 μL (12 oyuklu plaka) veya 2000 μL (6 oyuklu plaka). Şekil 1'de ADM'nin TGF-α (50 ng / mL) ile stimülasyon yoluyla indüklendiğine dikkat edin.
- Hücrelerin bazal membran matrisine gömülmesi için, tek parçalı bazal membran matrisini iki parçalı hücre süspansiyonu ile karıştırın. Kollajende olduğu gibi, matris hücre süspansiyonunu ve plakayı buz üzerinde tutun. 4.2.1'de belirtilen aynı hacimleri kullanarak her seferinde bir kuyu pipetleyin ve eşit dağılım için döndürün.
- Plakayı katılaşması için 30 dakika boyunca bir hücre kültürü inkübatörüne (37 ° C,% 5 CO2) yerleştirin ve ardından herhangi bir uyaran veya inhibitör ile 1x Waymouth'un tam ortamını ekleyin (Şekil 1, 50 ng / mL'de TGF-α kullanır). Medyayı (uyaran veya inhibitör ile) ertesi gün ve daha sonra her gün değiştirin. Uyarana bağlı olarak, ADM 3. gün ile 5. gün arasında gözlemlenebilir.
