Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
İhtiyaç duyulan cerrahi aletler Şekil 1'de ve işlemin şematik diyagramı Şekil 2'de gösterilmiştir.
1. Çözümler
- 1 L HBSS (1X) yapmak için 900 mL damıtılmış suya 100 mL 10X HBSS (stoktan) ekleyerek Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini (HBSS) hazırlayın.
- 450 mL buz gibi soğuk 1X HBSS'ye 50 mL 100X fetal sığır serumu (FBS) ekleyerek STOP solüsyonu hazırlayın (taze yapılmalı ve 1 saat içinde kullanılmalıdır); bu 500 mL STOP solüsyonu yapar. STOP çözeltisini 4 °C'de tutun.
- Buz gibi soğuk 1X HBSS'ye 1 mg / mL kollajenaz P ekleyerek kollajenaz P çözeltisi hazırlayın (kullanıldıktan sonra 1 saat içinde taze yapılmalıdır); 6 mL / fare kullanın.
- Kollajenaz P çözeltisine% 0.05 (a/h) sığır serum albümini (BSA) ekleyin (bu, izole edilen adacıklara besin sağlar). Örneğin, 6 mL kollajenaz P çözeltisinde 3 mg BSA kullanın. Buz üzerinde tutun.
- 50 mL'lik bir tüpte tüm fareler için gereken kollajenaz P miktarını hesaplayın ve hazırlayın.
- %10 FBS, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, INS-1 hücre takviyesi (10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat ve 0.05 mM 2-merkaptoetanol) ekleyerek tam RPMI 1640 ortamını hazırlayın
.
2. Hazırlık
- Üç adet 50 mL'lik tüpü 25 mL RNaz inhibe edici solüsyon,% 70 etanol veya damıtılmış H2O doldurun. Bu solüsyonlar, işlem öncesinde ve sırasında cerrahi aletlerin temizlenmesi için kullanılacaktır.
- Protokole başlamadan önce aletlerin uçlarını RNase inhibe edici solüsyonda 30 dakika bekletin; bu, aletler üzerindeki herhangi bir potansiyel RNase'yi ortadan kaldırır.
- Ameliyat sırasında kullanım için 6 inç x 6 boyutunda önceden kesilmiş emici pedler.
- 1X HBSS solüsyonunu önceden hazırlayın ve 4 °C'de saklayın. Ameliyattan önce STOP solüsyonu hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
- Ameliyattan hemen önce kollajenaz P solüsyonu hazırlayın ve buzda saklayın.
not: Bu, hazırlandıktan sonraki 2 saat içinde kullanılmalıdır.
- Sindirim ve saflaştırma için 50 mL'lik tüpleri etiketleyin; Her fare için biri sindirim ve diğeri adacık saflaştırması için 2 tüp hazırlayın. Hayvan kimliğinin her iki tüpte de olduğundan emin olun.
- İlk 50 mL'lik tüpe 3 mL kollajenaz P çözeltisi ekleyin. Kalan 3 mL kollajenaz P enjekte edilecektir.
- Kalan 3 mL kollajenaz solüsyonunu 30 G 1/2 iğne ile monte edilmiş 3 mL'lik bir şırıngaya çekin. Şırıngayı buzun üzerine yerleştirin.
3. Prosedür
- Tüm aletleri RNase inhibe edici solüsyondan çıkarın, daha sonra önce% 70 etanol içeren tüpe, daha sonra damıtılmış H2O içeren tüpe batırın, daha sonra temiz kağıt havlu üzerinde havayla kurutun.
- Fare derinlemesine anestezi uygulanana kadar fareyi 0,5 mL izofluran içeren bir odaya yerleştirin.
- Fareyi odadan çıkarın ve forseps ile bir ayak pedini sıkıştırarak anestezi durumunu kontrol edin. Derin anestezi, solunumun giderek yavaşladığı ve farenin ayak sıkışmasına tepkisiz olduğu gözlemine dayanır. Farenin derin anestezi uygulandığını onayladıktan sonra, fareyi servikal çıkık ile ötenazi yapın ve ardından fareyi emici pedin üzerine yerleştirin.
- Anestezi uygulanmış fareyi karnına yerleştirin, boynuna baskı uygulayın ve kuyruğunu çekerek omurgayı beyinden çıkarın.
- Farenin uzuvlarını sırtüstü pozisyonda emici pede bantlayın, vücuda %70 etanol püskürtün ve fazla etanolü silin.
- Kesi yapmak için kapak camı, forseps ve kavisli cerrahi makas kullanın. Önce karın bölgesinin cildinde yatay bir kesi yapın (~ 3 cm), karın duvarını ortaya çıkarmak için cildi tamamen açın. Daha sonra karın boşluğundaki pankreası tamamen ortaya çıkarmak için karın peritonu üzerinde dikey bir kesi (~ 3-4 cm) yapın (Şekil 3).
- Safra kanalını ortaya çıkarmak için karaciğerin loblarını üst kısımlara doğru itin, soluk pembe bir tüp olarak görünecektir (Şekil 3).
- Bağırsakları karın boşluğunun sağ lomber/iliak bölgesinden sağa doğru dikkatlice hareket ettirin, safra kanalını ve hepatik arteri açığa çıkarın (Şekil 3).
- Schwartz mikro serrefinelerini (Şekil 1) karaciğere mümkün olduğunca yakın kullanarak ortak safra kanalını dikkatlice klempleyin.
- Pankreas kanalı ile ortak safra kanalının birleşmesiyle oluşan duodenal papillada bulunan Vater ampullasını tanımlayın. Vater ampullası, koledok kanalına giriş noktası olan diseksiyon mikroskobu altında bakıldığında şişmiş görünür (Şekil 4).
not: Diseksiyon mikroskobunun ışık yoğunluğunu/açısını ayarlamak, yerini belirlemeyi kolaylaştırabilir.
- Şırıngayı 3 mL kollajenaz P çözeltisi ile Vater'in ampullasına yerleştirin. Şekil 5'te gösterildiği gibi iğneyi ortak safra kanalının (ampulla kanala girer) uzunluğunun yaklaşık 1 / 4'ü kadar kanala itin.
- İğne ampullanın içine girdikten sonra, iğnenin yönünün kanala paralel olacak şekilde olduğundan emin olun.
- Kanalı delmesini önlemek için iğneyi mikro Adson forseps ile sıkıştırarak stabilize edin (Şekil 5).
- Şekil 6'da gösterildiği gibi, şırıngadan 3 mL kollajenaz P solüsyonunu yavaş ve istikrarlı bir şekilde ortak safra kanalına (direnç hissedecek kadar) enjekte edin. Amaç, kollajenazı pankreas kanalına girmeye zorlamak için geri akış basıncı oluşturmaktır. Pankreasın baş, boyun, gövde ve kuyruk bölgesinin tamamı tamamen şişirilmişse enjeksiyon başarılı kabul edilir.
not: Pankreas tam olarak şişirilmemişse veya dalak alanı tam olarak şişirilmemişse adacık verimi düşük olacaktır. Dalak alanı en fazla adacıksayısını içerir 6. Şişirme, çözelti ile doldurulmuş pankreas dokusu arasındaki açık alanların ortaya çıkmasıyla doğrulanabilir.
- Şişirilmiş pankreası dikkatlice inceleyin ve 3 mL buz gibi soğuk kollajenaz P çözeltisi içeren 50 mL'lik bir sindirim tüpüne yerleştirin.
- 2 forseps kullanarak pankreası çıkarın (kavisli ve Mikro Adson; Bkz. Şekil 1): (dalaktan başlayarak, pankreası dalaktan uzaklaştırın ve mideden ve duodenum boyunca çıkarmaya devam edin.
not: Kesi gerekmez.
- İnce cerrahi makas kullanarak 3 mL buz gibi soğuk kollajenaz P solüsyonu ile sindirim tüpünde pankreası 3-5 saniye doğrayın (Şekil 7A).
- Tüpü 37 °C su banyosunda bir rafa sabitleyin ve 100–120 rpm'de yaklaşık 12–13 dakika çalkalayın.
- İnkübasyondan sonra, kollajenaz P sindirim çözeltisi homojen hale gelene kadar dokuyu bozmak için tüpleri elinizle hafifçe sallayın (Şekil 7B). Homojenlik, ince pankreas parçacıklarının kum benzeri bir görünümü ile doğrulanır. Yaklaşık 30 saniye hafif el sıkışma genellikle yeterlidir. Dokunun iyi homojenize olup olmadığını kontrol etmek için tüpü ışığa tutun; Gerekirse ~ 15 saniye daha çalkalayın.
- Sindirildikten sonra, tüpleri hemen buzun üzerine yerleştirin ve enzimatik sindirimi sonlandırmak için 40 mL buz gibi soğuk STOP solüsyonu ekleyin.
not: Bu noktada, birden fazla fare üzerinde çalışılıyorsa, sindirim tüpleri 2 saate kadar buz üzerinde bırakılabilir.
- Tüpü sallanan kovalı bir santrifüjde 30 s boyunca 300 x g'da santrifüjleyin (santrifüj sıcaklığı esnektir).
not: Doku peletinin tüpün duvarında değil, 50 mL'lik tüpün dibinde oluşması için sallanan bir kova santrifüjü kullanın; Bu, daha iyi adacık verimi için kritik öneme sahiptir.
- STOP çözeltisi ile santrifüjlemeyi boşaltın ve 2 kez daha tekrarlayın, her dönüşten sonra çözeltiyi boşaltın. Sonraki her yıkama için 20 mL STOP solüsyonu kullanın.
- Her döndürmeden önce, 50 mL'lik tüpteki doku peletini 20 mL STOP solüsyonunda hafifçe sallayarak peleti parçalayın.
- Doku peletini 40 mL buz gibi HBSS ile tekrar süspanse edin ve 30 saniye boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
- HBSS çözeltisi ile sallanan kovalı bir santrifüj kullanarak santrifüjlemeyi boşaltın ve iki kez daha tekrarlayın, her sıkmadan sonra çözeltiyi boşaltın. Her yıkama için 20 mL HBSS kullanın.
- Her sıkmadan önce, 20 mL HBSS çözeltisi içeren tüpü hafifçe sallayarak tüpün altından ayırmak için peleti parçalayın.
- Son santrifüjlemeden sonra tüm HBSS'yi çıkarın.
- Ardından, peleti içeren 50 mL'lik tüpe 5 mL oda sıcaklığında yoğunluk gradyanı ekleyin. Homojenize olana kadar düşük hızda kısa bir süre sarın.
- 50 mL'lik tüpe 5 mL oda sıcaklığı yoğunluk gradyanı daha ekleyin. Girdap/karıştırma yapmayın.
not: Bozulmadan daha iyi gradyanın oluşmasına izin vermek için sabit ve hareketsiz kalmak çok önemlidir.
- 10 mL oda sıcaklığında HBSS tamponunu tüpe (yoğunluk gradyanını içeren) pipetleyin, bir gradyan oluşmasına izin vermek için yavaşça ve yavaşça damla damla. HBSS'yi damla damla eklemek için 10 mL pipetli bir pipet tabancası kullanın.
- Sallanan kovalı bir santrifüj kullanarak, tüpleri 15 dakika boyunca 1700 x g'da döndürün. Eğimi korumak için her iki hızlanma/yavaşlama hızını en düşük ayara getirdiğinizden emin olun (Şekil 7C).
- Sıkma işleminden sonra, gradyanı bozmadan tüpleri dikkatlice çıkarın. Soğuk HBSS ile önceden ıslatılmış bir pipet tabancası (HBSS yukarı ve aşağı pipet) kullanarak, yoğunluk gradyanı ile HBSS arasında oluşan adacık tabakasını (5-10 mL) yeni 50 mL'lik adacık toplama tüpüne pipetleyin.
not: Adacıkların pipetin iç duvarlarına yapışmasını önlemek için adacıkları pipetlemeden önce pipeti soğuk HBSS ile ıslatmak faydalı olacaktır.
- Ayırmanın eksik olması durumunda, adacıklar yoğunluk gradyan katmanında görünür olacaktır, arayüzde oluşan adacık tabakası ile birlikte yoğunluk gradyanının (alt katman) 10 mL'lik kısmının tamamını pipetleyin (sadece HBSS üst tabakasının yaklaşık 8-10 mL'sini geride bırakmak için).
not: Hem adacık katmanının hem de yoğunluk gradyan katmanının (alt katman) toplanması, adacık toplama süresini uzatabilecek döküntülerin toplanmasına neden olabilir, ancak başka hiçbir adım değiştirilmeyecektir. Adacık tabakası iyi oluştuğunda bu tabakaların her ikisinin de toplanması gerekli değildir.
- Adacıklar içeren yeni 50 mL'lik tüpe 20 mL buz gibi soğuk HBSS ekleyin, ardından sallanan kovalı bir santrifüjde 3 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin.
- Sıkma işleminden sonra, altta adacıkları içeren peleti bozmadan süpernatanı (altta ~ 3 mL bırakın) dikkatlice pipetleyin (boşaltmayın). Süpernatanı atın.
- Yıkama ve santrifüjlemeyi en az 3 kez tekrarlayın. Her seferinde 20 mL HBSS ekleyin ve her dönüşten önce peleti askıya aldığınızdan emin olun.
- RPMI-1640 tam medya şişesini kullanmadan önce 37 °C'de bir su banyosunda ısıtın. Son santrifüjlemeden sonra, tüm HBSS'yi çıkarın ve pelete 4 mL önceden hazırlanmış tam RPMI-1640 ortamı (FBS, INS-1 hücre takviyesi ve penisilin / streptomisin içeren) ekleyin.
- Tüpü hafifçe döndürerek peleti yerinden çıkarın ve hemen RPMI-1640 ortamını 100 mm'lik bir Petri kabına dökün. Tüpe 5 mL daha RPMI-1640 ortamı ekleyin ve kalan adacıkları yıkamak için hafifçe döndürün, ardından ortamı aynı Petri kabına dökün.
- Diseksiyon mikroskobu altında, 20 μL'lik bir pipet kullanarak Petri kabından sağlıklı adacıklar toplayın ve bunları 10 mL tam RPMI 1640 ortamı içeren yeni bir Petri kabına koyun. Diseksiyon mikroskobu altında bakıldığında, adacıklar nispeten şeffaf, incecik ekzokrin dokuya kıyasla pürüzsüz bir yüzeye sahip küresel/dikdörtgen ve altın-kahverengi renkte görünmelidir.
not: Diseksiyon mikroskobunun büyütmesi genellikle 12.5-16x olarak ayarlanır. Adacık verimi, farenin türü, yaşı ve cinsiyeti gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak değişecektir. Bu protokol genellikle 4-10 aylık sağlıklı C57BL / 6J fareden 250-350 sağlıklı adacık verir.
- Ertesi gün deneyler için adacıkları steril bir inkübatörde 37 °C'de %5 CO2 infüzyonu ve %95 nemlendirilmiş hava ile gece boyunca inkübe edin veya daha sonra istenen analiz için adacıkları dondurun.
- Adacıklar dondurulduktan sonra, salgı tahlilleri için kullanılamazlar, sadece RNA veya protein miktar tayini için kullanılırlar. Hücreleri dondurmak üzere toplamak için, bunları HBSS tamponuna yerleştirin, tüm adacıkları 200-500 μL tamponda toplayın, 1.5 mL tüpe aktarın, 1-2 dakika boyunca 350 x g santrifüjleyin, süpernatanı 30-40 μL'den fazla olmayan çözelti bırakarak çıkarın, kısa süreli depolama için -20 ° C'ye yerleştirin (birkaç gün) veya uzun süreli depolama için -80 ° C'ye yerleştirin.
