Sferoidlerin İmmünofloresan Boyanması: Hücre İçi ve Hücre Dışı Antijen Ekspresyonunun Ekspresyonu için Spheroidleri Analiz Etme Tekniği

Özet

Kaynak: Cavaco, A. C. M. et al. Kanserle İlişkili Fibroblastların Farklılaşması ve İn Vitro Çalışmaları için Daha Fizyolojik Bir Sistem Olarak Bir 3D Küresel Model. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu videoda, fibroblastların veya CAF'lerin farklılaşmasını anlamak için sferoidlerin immünofloresan boyama tekniği açıklanmaktadır. Bu protokol, sferoidler içinde ECM proteinlerinin birikimi de dahil olmak üzere hücre içi ve hücre dışı antijenlerin ekspresyonunu tespit etmeye yardımcı olur.

Protokol

1. Sferoidlerin immünofloresan boyanması

1. Sferoidleri yaklaşık 24 saat sonra, deneysel koşul başına veya analiz edilecek protein başına 1.5 mL'lik bir reaksiyon tüpüne toplayın. Örneğin, TGF-β1 ile uyarılan iNF'lerin sferoidlerini, tedavi edilmeyen kontrol iNF'lerinden farklı bir tüpe yerleştirin. Çok güçlü kesme kuvvetleri nedeniyle sferoidlerin yırtılmasını önlemek için, deliği büyütmek için pipet ucunun ucunu kesin. Çoğaltmalara izin vermek ve yıkama adımları sırasında olası kayıpları hesaba katmak için bir reaksiyon tüpüne en az 5-10 sferoid ekleyin.
2. Sferoidleri bir tezgah üstü santrifüj ile 1.000 x g'da yaklaşık 30-60 s santrifüjleyin. Metilselüloz içeren süpernatanı, peletlenmiş sferoidleri rahatsız etmeden pipetleme yoluyla dikkatlice çıkarın.
3. 50 μL 1x PBS ile yıkayın. Santrifüjleme adımını tekrarlayın ve PBS'yi 1.2'de açıklandığı gibi pipetleme yoluyla dikkatlice çıkarın.
4. Boyanacak proteine bağlı olarak, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS'de 50 μL %4 paraformaldehit ile sabitleyin (αSMA, NG2 ve integrin α3β1 için) veya -20 °C'de 10 dakika boyunca 50 μL metanol ile (laminin-332 alt birimleri için).
5. Yıkama adımını adım 1.2-1.3'te açıklandığı gibi tekrarlayın.
6. Hücreleri PBS'de% 0.1 Triton-X ile oda sıcaklığında 4 dakika boyunca geçirgen hale getirin.
7. Adım 1.2-1.3'te açıklandığı gibi yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
8. Spesifik olmayan protein etkileşim bölgelerini bloke etmek için RT'de 1 saat boyunca% 5 FBS ve% 2 BSA içeren sferoidleri inkübe edin.
9. Sferoidleri gece boyunca 4 ° C'de PBS,% 2.5 FBS ve% 1 BSA'da 30 μL primer antikorlarla inkübe edin. Aşağıdaki primer antikorlar kullanıldı: 5 μg/mL'de anti-αSMA Cy-3 konjuge ve anti-NG2; BM2 anti-laminin α3, 6F12 anti-laminin β3 ve anti-laminin γ2 20 μg/mL.
10. Adım 1.2-1.3'te açıklandığı gibi yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
11. Sferoidleri PBS'de 30 μL ikincil antikorlar, RT'de% 2.5 FBS ve% 1 BSA ile 90 dakika boyunca inkübe edin. Kullanılan aşağıdaki ikincil antikorlar şunlardı: Alexa 488 anti-tavşan ve anti-fare (5 μg/mL).
12. Adım 1.2-1.3'te açıklandığı gibi yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
13. Hücreleri 30 μL DAPI boyama solüsyonu ile oda sıcaklığında 4 dakika inkübe edin.
14. Yıkama adımını adım 1.2-1.3'te açıklandığı gibi tekrarlayın.
15. Sferoidleri bir cam Pasteur pipeti kullanarak bir damla PBS'ye bir cam slayt üzerine yerleştirin.
16. Sferoidleri 10x büyütme kullanarak bir lazer tarama mikroskobunda floresan mikroskobu ile görüntüleyin. Bir z-yığınının farklı optik düzlemlerinde (15-20 yığın düzlemi) sferoidin farklı optik kesitini alın. Mikroskopta lazer ayarlarını oluşturmak için, ilgilenilen antijen için negatif hücrelerden oluşan bir sferoid veya sadece ikincil antikorla boyanmış bir sferoid kullanın. Karşılaştırılacak tüm örnekler için aynı ayarları yeniden kullanın.
17. Mikroskobik görüntüleri daha önce yayınlandığı gibi ImageJ yazılımıyla analiz edin. Adımlar Şekil 1'de özetlenmiştir. Arka plan olarak, hücresiz bir ilgi bölgesinin (ROI) entegre sinyal yoğunluğunu belirleyin. Toplam düzeltilmiş hücre floresansını (TCCF) şu şekilde hesaplayın:
    TCCF = entegre sinyal yoğunluğu - (seçilen sferoidin alanı x arka planın ortalama floresansı)
18. Sferoidlerin toplam düzeltilmiş floresansını (TCF), TCCF sferoid alanına ve yığın sayısına normalize edildiğinde belirleyin.
    TCF = Kürenin TCCF'si / (kürelerin alanı x yığın sayısı)

Sonuçlar

Şekil 1. ImageJ kullanılarak, sferoidlerde ilgilenilen bir proteinin immünofloresan boyanmasının miktar tayini için sıralı adımlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
4',6-Diamidino-2-fenilindol, dihidroklorür (DAPI)	SIGMA-ALDRICH	D9542-10
6F12 anti-Laminin β3 alt birim Fare (monoklonal)			Ev yapımı
Albümin Fraksiyonu V - BSA	Uygulama Kimyası	A1391
Alexa fluor 488 Keçi (poliklonal) anti-Fare	Canlandırıcı	A11029
Alexa fluor 488 Keçi (poliklonal) Tavşan	Canlandırıcı	A11034
Anti-laminin γ2 alt birimi Fare (monoklonal)	Santa Cruz Plajı	SC-28330
Tezgah üstü santrifüj	Balıkçı Bilimsel	50-589-620	filiz
BM2 anti-laminin α3 alt birimi Fare (monoklonal)			Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon tarafından sağlanmıştır.
Santrifüj tüpleri 50 mL	Corning	430290
Konfokal mikroskop	Zeiss
DMEM (Yüksek glikoz 4.5 g/L)	Fransa	BE12-604F
İnsan Primer Pankreatik Fibroblastları	PELOBiotech	PB-H-6201
Penisilin / streptomisin	Gibco (Gibco)	15140-122
Mikroskop Slaytları	Termo Bilimsel	J1800AMNZ
Paraformaldehit	Riedel-de Haën	16005
TritonX-100	SIGMA-ALDRICH	X100RS