Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve jove veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. SQ Tümörlerinin IRE'si
- Gerekli malzemeleri hazırlayın: kare dalga elektroporatörü, emniyetli ayak pedalı, elektrotlar (iğne dizisi ve cımbız) ve adaptörler. Steril dikişleri (emilmeyen 4-0), alkollü bezleri, saç kesme makinelerini, tüy dökücü kremi, göz kayganlaştırıcıyı, pamuklu gazlı bezi, buprenorfini ve anestezikleri de yakınınızda bulundurun.
- Cımbız veya iğne dizisi elektrotlarını gaz sterilizasyonu kullanarak sterilize edin. Otoklavlama tavsiye edilmez. Hayvanlar arasındaki elektrotları sterilize etmek için bir cam boncuk sterilizatörü kullanın.
- SQ tümör implantı 5 mm çapa ulaştığında farelerde anesteziyi başarılı bir şekilde indüklemek için adımları izleyin. Kısaca, ameliyattan 30 dakika önce alıcı fareye 0.05 - 1 mg / kg buprenorfin analjezik SQ uygulayın. Daha sonra, hassas bir buharlaştırıcı (veya diğer anestezik ajanlar) kullanarak alıcı fareleri oksijende (2 L / dak) %2 - 3 izofluran ile uyuşturun. Prosedürün tamamı boyunca fareleri 37 ° C'lik bir ısıtma yastığı üzerinde tutun. Kurumayı önlemek için gözlere kayganlaştırıcı sürün. Başlangıçta ürkütücü refleks eksikliği ile anestezi derinliğini test edin ve hafif bir ayak parmağı tutamına pedal refleksi eksikliği ile cerrahi düzlem anestezisini onaylayın. Tüm cerrahi prosedür boyunca anesteziyi koruyun.
- Yan taraftaki SQ tümörüne erişmek için anestezi uygulanmış fareyi yan yatırın. Saç kesme makinesi kullanarak tüyleri çıkarın ve alkollü bir bez kullanarak cildi temizleyin.
- SQ tümörleri için 2 iğneli dizi elektrotları kullanın. Forseps kullanarak cildi doğrudan tümör bölgesinin altına yükseltin ve elektrotları vücuda paralel olarak cildin içinden geçirin ve periton boşluğuna nüfuz etmediklerinden emin olun. Deriden geçtikten sonra, elektrotları tümörü braketleyecek şekilde konumlandırın.
- Elektroporatörü, toplam 150 darbe için 1.500 V/cm'de 1 Hz frekansında 100 μs darbe verecek şekilde programlayın. Ayak pedalını kullanarak darbeleri verin. Isı dağılımına izin vermek ve elektrotların doğru konumunu doğrulamak için her 10 darbe setini 10 saniye ayırın.
not: Paralitik ajanlar kullanılmadan, fareler, manuel olarak sabitlenmedikçe elektrotların yer değiştirmesine neden olabilecek IRE ile kas kasılmaları yaşayacaktır.
- 200 s'yi geçmemesi gereken tam dozlamadan sonra elektrotları çıkarın. Elektroporatörde görüntülenen gerçek voltajı kaydedin. Farelerin, yiyecek ve suya ücretsiz erişimi olan ev kafesinde IRE'yi takiben iyileşmesine izin verin. Geri kazanımı kolaylaştırmak için kafesi bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin. İyileşme sürecinde solunum, perfüzyon vb. gibi yaşamsal belirtileri izleyin. Fare iyileştikten sonra düzeltme refleksinin belirtilerini onaylayın ve ardından kafes kutusunu normal yuvasına geri koyun. Ameliyattan 8 - 12 saat sonra 0.05 - 0.1 mg / kg ve işlemden sonra ağrı belirtileri için gerektiğinde her 8 - 12 saatte bir buprenorfin uygulayın.
2. Ortotopik Tümörlerin IRE'si
NOT: Ortotopik tümörlerin IRE'si, aynı fare üzerinde ikinci bir sağkalım ameliyatını içerir, bu nedenle başlamadan önce yerel IACUC'tan özel onay gerektirir.
- Gerekli malzemeleri hazırlayın: makas, neşter, iğne ucu, sivri uçlu forseps ve düz uçlu forseps gibi cerrahi aletleri otoklavlayın. Aşağıdakileri de yakınınızda bulundurun: steril dikişler (emilebilir 6-0 ve emilmeyen 4-0), alkollü bezler, saç kesme makineleri, tüy dökücü krem, göz kayganlaştırıcı, pamuklu gazlı bez, %10 povidon iyot solüsyonu, cerrahi örtüler, ısıtma yastıkları, kare dalga elektroporatör, emniyetli ayak pedalı, elektrotlar ve adaptörleri, buprenorfin ve anestezikler.
- İn vivo biyolüminesans görüntüleme ile fareleri ortotopik tümör büyümesi açısından değerlendirin. Ortotopik implantasyondan sonraki 4. günden itibaren görüntüleme ile tümör büyümesini takip edin ve haftada iki kez görüntüleme yapın. Görüntüleme gününde, görüntülemeden 10 dakika önce anestezi uygulanmış (oksijende% 2-3 izofluran (2 L / dak)) alıcı fareye 30 mg / kg D-lusiferin uygulayın (intraperitoneal enjeksiyon). Otomatik floresan serbest ısıtmalı aşamalı bir lüminesans görüntüleyicide en az 5 saniye pozlama için herhangi bir emisyon filtresi olmadan lüminesans ayarı kullanılarak ve fareler için anesteziyi sürdürürken lusiferaz aktivitesi için görüntü.
not: Ortotopik tümörler, implantasyondan 8 ila 10 gün sonra, tümörlerin açıkça görülebildiği ve Luciferaz lüminesans görüntülerinde görülebileceği gibi hala pankreas ile sınırlı olduğu IRE tedavisi için idealdir
- İmplante edilmiş tümörü bulmak için adımları izleyin. Kısaca, ameliyattan 30 dakika önce alıcı fareye 0.05 - 1 mg / kg buprenorfin analjezik SQ uygulayın. Hassas bir buharlaştırıcı (veya diğer anestezik ajanlar) kullanarak alıcı fareleri oksijende (2 L / dak) %2-3 izofluran ile uyuşturun. Prosedürün tamamı boyunca fareleri 37 ° C'lik bir ısıtma yastığı üzerinde tutun. Kurumayı önlemek için gözlere kayganlaştırıcı sürün. Başlangıçta ürkütücü refleks eksikliği ile anestezi derinliğini test edin ve hafif bir ayak parmağı tutamına pedal refleksi eksikliği ile cerrahi düzlem anestezisini onaylayın. Tüm cerrahi prosedür boyunca anesteziyi koruyun. Fareyi sırt üstü yatırın ve karnın sol tarafı açıkta kalacak şekilde yavaşça sağ tarafına çevirin. Tüy dökücü krem kullanarak farenin karın kıllarını çıkarın ve kesi sonrası karın bölgesine serbest kıl girmemesini sağlamak için gazlı bezle temizleyin. Cildi dezenfekte etmek için 3 döngü %10 povidon iyot ve ardından alkollü mendil kullanarak sol karnı ameliyata hazırlayın. Steril bir neşter kullanarak, ciltte, orta hattın 1 cm solunda, göğüs kafesinin altında, dalağın hafif medialinde 1,5 cm'lik enine veya eğik bir kesi yapın. Ardından, kesiği karın kasları boyunca uzatın ve üstteki yüzeysel insizyonu yansıtın. Düz uçlu forseps kullanarak dalağı bulun ve karın boşluğundan nazikçe dışsallaştırın. Steril bir pamuk aplikatörü kullanarak dalağı geri çekin ve dalağın dibine bağlı pankreasın kuyruğunu bulun. Düz uçlu forseps kullanarak pankreasın kuyruğunu yanal olarak geri çekin. Tümörün yerini tespit etmek kolay değilse, tümörü tanımlamak için mideyi ve dalağı nazikçe hareket ettirmek için künt burunlu forseps kullanın.
- Tümörü künt burunlu forseps ile dışsallaştırın ve cımbızın platin elektrotları ile tümörü sıkıca yakalayın. Ayak pedalı tarafından kontrol edilen 1.7 darbeli setler halinde kare dalga elektroporatörünü kullanarak elektroporasyon darbelerini adım 10'de programlandığı gibi verin.
- Herhangi bir kanama belirtisi olup olmadığını izlemek için tümörü IRE'den sonra en az 60 saniye boyunca dışsallaştırılmış halde tutun. Tümörü karın boşluğuna geri yerleştirin ve insizyonu tarif edildiği gibi kapatın. Kısaca, sürekli veya kesintili bir dikişle 6-0 emilebilir bir sütür kullanarak karın kaslarını kapatın ve 3-0 ila 6-0 emilemeyen kesintili bir sütür kullanarak üstteki cildi kapatın. Bu noktada anesteziyi durdurun. Farenin 1.7'de açıklandığı gibi iyileşmesine izin verin. Fareyi iyileşene kadar izleyin.
- Adım 2.2'ye göre in vivo lusiferaz görüntüleme kullanarak IRE'nin tümör büyümesi üzerindeki etkilerini izleyin.
