Manyetik Olarak Biyobaskılı 3D Sferoid Ko-kültürler: Kanserli Hücrelerin ve Fibroblastların Birlikte Kültürlenmesi İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Noel P. et al.Pankreas Kanseri Hücreleri ve Fibroblastların 3 Boyutlu Küresel Ko-kültürlerinin Hazırlanması ve Metabolik Testi. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, birlikte kültürlenmiş pankreas kanseri hücrelerinin ve fibroblastların 3D manyetik biyo-baskısını açıklamaktadır. Pankreas kanseri hücreleri ve aktive edilmiş pankreas fibroblast hücreleri, manyetik kuvvetlerin etkisi altında sferoidler oluşturmak için biyouyumlu bir nanopartikül düzeneği kullanılarak birlikte kültürlenir ve manyetize edilir.

Protokol

1.Manyetik Biyobaskı Kullanarak Pankreas Kanseri 3D Sferoidlerinin Kültürü

1. Standart aseptik doku kültürü tekniği kullanılarak, bir T75 şişesinde ilgilenilen kültür hücreleri, uygun büyüme ortamında% 70-80'lik bir birleşime kadar kültür hücreleri.
   not: Tipik olarak,% 70-80 birleşik T75 şişesinden 5-7 ×^{10 6} hücre hasat edildi. Bu çalışmada iki farklı hücre tipi kullanıldı - Patu8902 (pankreas tümör hücreleri) ve PS1 hücreleri (aktive edilmiş pankreas yıldız hücreleri). Her iki hücre hattı da Roswell Park Memorial Institute media 1640'ta (RPMI-1640) kültürlendi ve %10 (h/h) fetal sığır serumu (FBS), 1× penisilin-streptomisin (p/s) ile desteklendi.
2. Hücreleri 5 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS) ile bir kez yıkayın.
3. 37 ° C'de 5-10 dakika boyunca 2 mL% 0.05 Tripsin-EDTA ile tripsiniz yaparak hücreleri plastik yüzeyden ayırın. Mikroskop altında hücre ayrılmasını kontrol edin.
4. Ayrılmış hücrelere 8 mL büyüme ortamı ekleyerek tripsini etkisiz hale getirin. Aşırı tripsinizasyondan kaçının, çünkü bu hücrelerin sağlığını / canlılığını olumsuz yönde etkileyebilir.
5. Tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyin ve otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücre yoğunluğunu sayın.
6. Bu arada, bir NS şişesini ortam sıcaklığına dengeleyin.
7. İstenilen sayıda sferoidin (kuyucuk) tohumlanması için gereken hücre miktarını hesaplayın ve 15 mL'lik yeni bir konik tüpe alikot yapın. Örneğin, 96 oyuklu bir plakanın tamamını 5.000 hücre/kuyu ile tohumlamak için en az 5.5 × 10⁵ hücre alikot.
8. 3 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyerek hücreleri toplayın. Süpernatanı dikkatlice karıştırın, kızartın veya boşaltın ve hücreleri büyüme ortamında 1.0 x 10⁶ hücre / mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin. Kesmeyi önlemek için geniş delikli bir pipet ucu kullanarak nazikçe pipetleyin. Örneğin, 550 μl büyüme ortamında 5.5 x 10⁵ hücreyi yeniden süspanse edin.
9. Dengelenmiş NS'yi kullanarak istenen miktarda hücreyi manyetize edin (adım 1.6).
   1. NS'yi doğrudan büyüme ortamındaki hücre süspansiyonuna ekleyin ve hafifçe çalkalayın. Hücrelerin verimli manyetik etiketlemesi için, 100 μL hücre başına 10 μL NS kullanın (1 x 10⁶ hücre / mL'de yeniden süspanse edilir).
      not: Tipik bir deney için, 55 μL NS ile 550 μL'de 5.5×10⁵ Patu8902 hücresini ve 1100 μL'de 1.1×^{10 6} PS1 hücresini (ayrı ayrı) 110 μL NS ile etiketleyin.
   2. Hücre süspansiyonunu sağlamak için tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirin. Geçici olarak, hücre-NS karışımını 24 oyuklu bir plakanın tek bir kuyucuğuna aktarın. Bunu, manyetize edilecek her hücre tipi için ayrı ayrı yapın. Plakayı örtün ve NS'nin hücre yüzeyine bağlanmasına izin vermek için hücreleri oda sıcaklığında 2 saat hafifçe çalkalayarak inkübe edin.
      not: Patu8902 veya PS1 tek başına hücrelerden başlayarak sferoidlerin kültürü ve tahlili, manyetik sürücülere basılmadan önce her iki hücre tipiyle başlayan ko-kültür sferoidlerine ek olarak, bağımsız deneylerde bu yöntem kullanılarak başarıyla gerçekleştirildi. Patu8902 ve PS2 hücrelerinden ko-kültür sferoidleri oluşturmak için bir yöntem, sonraki adımlarda aşağıda açıklanmıştır.
10. Eşit şekilde karıştırmak için manyetize hücreleri nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin ve istenen hücre sayısını içeren bir ana karışım hazırlayın. Sferoidleri tohumlamak için toplam 15.000 hücre (5.000 Patu8902 + 10.000 PS1) kullanın ve 96 oyuklu bir plakanın oyuğu başına toplam 150 μL hacmine ayarlayın.
    not: Her bir oyuğa dağıtılan son hacim, kullanılan hücre sayısından bağımsız olarak aynı olmalıdır.
11. 96 oyuklu manyetik sferoid sürücünün üzerine 96 oyuklu bir hücre itici plaka yerleştirin ve her oyuğa 150 μL hücre karışımı dağıtın. Hücrelerin yavaşça mıknatısın üzerindeki kuyunun merkezine toplandığını gözlemleyin. Plakayı, manyetik küresel sürücü hala takılıyken 37 ° C'ye ayarlanmış %5 CO₂ inkübatörde gece boyunca örtün ve inkübe edin. Manyetik sürücüyü çıkarın ve daha fazla büyüme için 7 güne kadar kuluçkaya yatırın.
    not: Manyetik sferoid sürücüler kullanarak küresel baskı için hücre itici büyüme plakalarının kullanılması çok önemlidir. Tutma sürücüsünün değil, daha ince daha küçük mıknatıslara sahip küresel sürücünün kullanıldığından emin olun.
12. Her gün sferoidlerin büyümesini izleyin. Manyetik tutma tahrikine monte edilmiş büyüme plakasını belirli bir açıyla yerleştirerek ve kullanılmış ortamı çıkarmak için çok kanallı bir pipet kullanarak her üç günde bir taze büyüme ortamı ile doldurun.
    not: 15.000 hücre / kuyuda birlikte tohumlanan Patu8902 ve PS1 hücreleri, 5-7 gün içinde 400-600 μm çapında 3D sferoidlere dönüşecektir. Bu noktada sferoidler metabolik karakterizasyon, ilaç değerlendirmesi ve diğer alt uygulamalar için hazırdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 0.05 Tripsin EDTA	Sigma	25300-054
96 kuyulu hücre itici plaka	ABD Bilimsel / Griener Bio-One	655970	Küresel büyüme plakası
Çellometri Hücre sayma slaytları	Nexcelom	CHT4-SD100-002
n3D Manyetik Küresel sürücü	Nano3D Biyobilim	655841	Küresel Biyobaskı Kitinin Bir Parçası
n3D Manyetik Küresel tutma sürmek	Nano3D Biyobilim	655841	Küresel Biyobaskı Kitinin Bir Parçası
n3D NanoMekik-PL	Nano3D Biyobilim	655841	Küresel Biyobaskı Kitinin Bir Parçası: 4 °C'de saklayın
Patu8902 hücreleri	Laboratuvar Stoğu		Pankreatik duktal adenokarsinom Hücre
PS1 hücreleri	Laboratuvar Stoğu		Aktive Pankreas Yıldız Hücreleri
RPMI1640	Gibco (Gibco)	11875-093	Hücreler, sferoidler için büyüme ortamı