1. Hücre Dışı Akı Analizörü kullanılarak Biyoenerjetik Yollar için 3D Pankreas Tümör Sferoidlerinin Metabolik Testi
NOT: Bu bölümde, 3D sferoidler için özel olarak tasarlanmış tahlil mikroplakalarına sahip bir hücre dışı akı analizörü kullanılarak sferoidlerin metabolik fonksiyonlarının analizi açıklanmaktadır.
- Büyüme plakalarından sferoid tahlil mikroplakalarına sferoidlerin yıkanması ve aktarılması.
not: Sferoidler, ~ 500 μm çapa ulaştıklarında metabolik testler için kullanılabilir.
- Testi gerçekleştirmeden bir gün önce, prob veya sensör kartuşunu sağlanan yardımcı plakada tahlil kalibrantı (200 μL / kuyucuk) ile nemlendirin ve gece boyunca (4-18 saat) 37 ° C'ye ayarlanmış nemlendirilmiş bir inkübatörde (CO2 olmayan) inkübe edin.
- Baz ortamı (Malzeme Tablosuna bakınız) glikoliz stres testi (GST) testi için 2 mM L-glutamin veya mitokondriyal stres testi (MST) testi için 1 mM piruvat, 2 mM L-glutamin ve 10 mM glikoz ile destekleyerek istenen metabolik test için uygun tahlil ortamını hazırlayın.
not: Hücre dışı akı analizörü, 96 oyuklu bir plaka formatında canlı hücrelerin hem mitokondriyal solunumunu (OCR) hem de glikolizini (ECAR) ölçer. Bu oranlar, incelenen örneklerde hücresel metabolik fonksiyona genel bir bakış sağlar. Ayrıntılı talimatlar için lütfen tahlil kitlerindeki kılavuza bakın.
- Teste özgü takviyeleri ekledikten sonra (bkz. Adım 1.1.1), takviye edilen tahlil ortamını 37 ° C'lik bir su banyosunda ısıtın ve pH'ı 0.1N NaOH ile 7.4 ± 0.1'e ayarlayın. Kullanana kadar ortamı sıcak tutun.
- Test kiti reaktiflerini kalibre edilmiş tahlil ortamında önerilen stok konsantrasyonlarına göre yeniden oluşturun.
not: Bunlar, kuyularda istenen nihai konsantrasyonun ×10'unda yapılır. Glikoz, oligomisin ve 2-deoksi-glikoz (2-DG) için stok konsantrasyonları sırasıyla 100 mM, 100 μM ve 500 mM'dir.
- Küresel morfolojiyi ve genel tekdüzeliği kontrol etmek için büyüme plakasındaki sferoidleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin; sferoidlerin şekli ve yapısı açısından.
- Büyüme plakasını manyetik bir tutma sürücüsüne aktarın ve ~ 120 μL büyüme ortamını dikkatlice aspire edin. Sferoidleri ~ 120 μL ısıtılmış ve önceden kalibre edilmiş tahlil ortamı ile nazikçe yıkayın, aspire edin ve yıkamayı iki kez tekrarlayın. Sferoidlerin yıkanmadığından emin olmak için sferoidleri mikroskop altında tekrar inceleyin.
- Her bir oyuğa 180 μL ılık tahlil ortamı ekleyerek küresel tahlil mikroplakasını hazırlayın.
- Bir P20 mikropipeti 10 μL'ye ayarlayın ve üzerine geniş delikli bir uç takın. Geniş delikli uçlar mevcut değilse, deliği genişletmek için normal pipet uçlarının uçlarını temiz bir makas veya neşterle kesin.
not: Bu, kesmeyi azaltmalı ve tahlil plakalarına aktarılırken sferoidlerin genel morfolojisini korumalıdır.
- Kürelerin transferini gerçekleştirmek için ılık (37°C) bir yüzey kullanın. Aktarım işlemi sırasında kontrastı artırmak ve sferoidlerin görselleştirilmesine yardımcı olmak için beyaz ışıklı bir lamba ile ısıtılan bir X-ışını film görüntüleyici yüzeyi kullanın.
- Geniş delikli bir uca sahip bir P20 mikropipet kullanarak hücre itici büyüme plakasından önceden yıkanmış tek bir sferoidi dikkatlice aspire edin ve metabolik tahlili gerçekleştirmek için sferoidi doğrudan bir küresel tahlil plakasının her bir oyuğunun merkezine nazikçe aktarın. Tahlil plakasını doldurmak için her bir sferoidin saf yerçekimi ile her bir kuyucuğun merkezi mikro odasına nazikçe düşmesine izin verin.
not: Her bir sferoidin yerçekimi ile kuyunun merkezine düşmesi genellikle 5-8 saniye sürer. Sferoidler mikro hazneye yerleşene kadar pipeti dışarı çekmeyin. Tahlil plakasının 4 köşe kuyusuna (A1, A12, H1, H12) sferoidleri bırakmayın, çünkü bunlar arka plan kuyuları olarak kullanılacaktır.
- Her bir sferoidin her bir kuyucuğun merkezinde olduğundan emin olmak için her bir sferoidin morfolojisini ve konumunu izleyin. Gerekirse, geniş delikli bir pipet ucu kullanarak sferoidi aspire ederek ve ardından yerçekimi ile biriktirerek kuyu merkezine yeniden konumlandırın.
- Tüm sferoidler transfer edildikten sonra, tahlil plakasını tahlilden bir saat önce 37 °C nemlendirilmiş hava inkübatörüne (CO2 olmayan) yerleştirin.
- Sensör kartuşunun bileşiklerle yüklenmesi ve tahlilin yapılması
- Adım 1.1.2'de açıklanan teste özgü ortamda ×10 konsantre tahlil spesifik reaktifleri hazırlayın. Örneğin, GST'yi gerçekleştirmek için, tahlil kılavuzunda atıfta bulunulan önerilen hacimlerde glikoz, oligomisin ve 2-DG'yi sulandırın. Hem GST hem de MST testleri Patu8902-PS1 sferoidleri kullanılarak gerçekleştirildi.
- Sensör kartuşunu sol tarafta AH etiketli sıralarla düzgün bir şekilde yönlendirin ve sensör kartuşunun üzerine bir yükleme kılavuzu yerleştirin. Yükleme kılavuzunu, yüklenecek limana karşılık gelen harf sol üst köşede olacak şekilde yönlendirerek istenen limanın doğru şekilde yüklendiğinden emin olun.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak, reaktifleri doğrudan enjeksiyon portlarına dağıtın. Prosedür boyunca parmak uçlarınızı kullanarak yükleme kılavuzlarını yerinde tutun.
not: Her reaktif, tahlil kılavuzunda atıfta bulunulan önerilen bir porta enjekte edilecektir. Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının, ancak hava kabarcıklarını çıkarmak için kartuşun herhangi bir parçasına dokunmayın.
- Yükleme kılavuzunu çıkarın ve enjeksiyon portlarını eşit yükleme açısından görsel olarak incelemek için kartuşla göz hizasına yerleştirin.
- Bölüm 1.3'te açıklandığı gibi cihaz kontrolörü Wave yazılımını (bundan böyle analiz yazılımı) kullanarak deneysel tahlil tasarımını/cihaz protokolünü oluşturun.
- Analiz yazılımı kullanılarak tahlil tasarımı ve yürütülmesi
- Deney için bir tahlil şablonu oluşturun
- Analiz yazılımını açın ve "Şablonlar"a tıklayın veya mevcut bir tahlil şablonundan seçim yapın. "Boş Şablon" üzerine çift tıklayın.
- Deney gruplarını ve koşullarını tanımlar.
- A, B ve C bağlantı noktaları için Ekleme stratejilerini tanımlayın. D bağlantı noktasını boş bırakın.
not: GST tahlili için sadece bu portlara Glikoz, Oligomisin ve 2-DG yüklenecektir. MST testi durumunda, oligomisin, FCCP ve rotenon yüklenecektir.
- Sferoidler bir veya daha fazla test bileşiği ve kontrol grubu ile tedavi edildiyse ön tedavileri tanımlayın. Tahlil ortamını kaynağı, ekleri ve diğer bilgileri içerecek şekilde tanımlayın.
- Yoğunluk ve geçiş sayısı bilgilerini görerek bir veya daha fazla hücre tipi (örneğin Patu8902, PS1) tanımlayın.
- "Grup Oluştur" u tıklayın.
- "Plaka Haritası" sekmesine tıklayın ve deney tasarımına karşılık gelen tahlil plakasına gruplar atayın.
- Dört köşe kuyusunu arka plan kuyuları olarak seçin. Bu kuyucuklarda sferoid olmadığından emin olun.
- Analizörde tahlili çalıştırın
- "Kalibre Et", "Dengele" ve "Temel Ölçüm Döngüsü" seçeneklerini işaretleyerek varsayılan protokol komutlarını koruyun.
- "Enjeksiyonlar"a tıklayın ve her bağlantı noktası için bileşik tanımlayın. Ölçüm döngülerini sferoidler için varsayılan 3 döngüden 6 döngüye düzenleyin. Varsayılan 3 dakikalık karışım, 0 dakikalık bekleme ve 3 dakikalık ölçüm sürelerini koruyun.
not: Varsayılan karışım-bekleme-ölçüm süreleri sırasıyla 3 dakika, 0 dakika, 3 dakikadır. İlk tahlil bileşiğinin enjeksiyonundan önce tipik olarak üç bazal oran ölçümü alınır. Bu ölçümler deney tasarımına göre kalibre edilebilir ve yeniden ayarlanabilir.
- Protokol ve Grup Özeti'ni gözden geçirin.
- Tahlil tasarım şablonunu kaydedin.
- Enjeksiyon portları tahlil substratları ile yüklendikten sonra tahlil öncesi kalibrasyona devam edin. Yardımcı plakalı kartuşu hücre dışı akı analizörüne aktarın.
not: Bu genellikle 15-20 dakika içinde tamamlanır ve OCR ve ECAR ölçümleri yapmak için sensörleri kalibre eder.
- Kartuşun kalibrasyonundan sonra, yardımcı plakayı 3D sferoidler içeren önceden ısıtılmış test plakası ile değiştirin ve testi başlatın. Ölçümler tamamlandıktan sonra, verileri analiz etmek için verileri elektronik tabloya veya grafik ve istatistiksel yazılıma aktarın.
