PDAC Kök Hücre İzolasyonu: Kanser Kök Hücrelerini Pankreas Tümörlerinden İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Lonardo, E., et al. Yeni tedavi stratejileri geliştirmek için pankreas kanseri kök hücre özelliklerinin incelenmesi. J. Vis. Uzm. (2015).

Bu makalede, insan pankreas duktal adenokarsinomu (PDAC) dokusundan pankreas kanseri kök hücrelerinin (CSC'ler) izole edilmesi tekniği açıklanmaktadır. Bu CSC'ler, daha etkili kanser tedavileri geliştirmek için ilaç tedavisinin CSC'lerin in vitro kendini yenileme kapasitesi üzerindeki fonksiyonel etkilerini incelemek için kullanılır.

Protokol

1. CSC'lerin İnsan PDAC'sinden İzolasyonu (Şekil 1)

1. Steril bir biyogüvenlik kabininde, insan PDAC dokusunu 1 ml steril 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 60 x 15 mm'lik bir kültür kabına aktarın. Steril bir neşter ve forseps kullanarak tümörü küçük parçalar halinde (1-5 mm) doğrayın.
2. Kültür kabına 1 ml steril 1X PBS ekleyin ve doku tamamen ayrışana kadar öğütme adımını tekrarlayın, bu düzenli olarak 3-4 tur gerektirir. Doku süspansiyonunu (1X PBS ile 5 ml'lik son hacme kadar) steril bir tüpe aktarın ve gentleMACS gibi bir ayrıştırıcı ile mekanik olarak homojenize edin.
3. Homojenize dokuyu kollajenaz ile inkübe edin (1X PBS'de 2.5 mg / ml kollajenaz kullanın) 37 ° C'de 60 dakika boyunca ve ardından 900 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın ve hücre peletlerini 10 ml tam ortamda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 40 μm'lik bir süzgeçten süzün ve 900 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
4. Süpernatanı boşaltın ve peleti 5 ml kırmızı kan hücresi lizis tamponu (amonyum-klorür-potasyum, ACK) ile yeniden süspanse edin ve
5. Peletleri CSC'ler ortamında yeniden süspanse edin, jelatin kaplı bir tabak üzerine koyun ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Bu adım, plakaya hızlı bir şekilde bağlanan fibroblast hücrelerinin çoğunu çıkaracaktır.
6. Plakayı inkübatörden çıkarın ve hücre süspansiyonunu dikkatlice geri kazanın ve bir hemositometre kullanarak canlı (tripan mavisi-negatif) hücrelerin sayısını ölçün. Bunun için, süspansiyonu nazikçe karıştırın ve süspansiyonun 20 μl'sini bir Eppendorf tüpüne pipetleyin. Mikrosantrifüj tüpündeki hücrelere 20 μl (1:1 oranında) tripan mavisi ekleyin ve iyice karıştırın. Karışımın yaklaşık 10 μl'sini hemositometreye pipetleyin.
7. Canlı hücre sayımı için sayım odasının dört köşe çeyreğindeki tüm boş hücreleri sayın.
   not: Hücrelerin canlılığı ve verimi, tümör örnekleri arasında önemli ölçüde değişebilir. PDAC örnekleri için canlılık düzenli olarak %45-70 arasında değişir ve 3-5 mm çapında makroskopik bir tümör örneğinden alınan doku parçaları yaklaşık 5x10⁶ canlı hücreye yol açmalıdır.

Sonuçlar

Şekil 1. Metformin seçici olarak CSC'leri hedefler.
(A) Metformin kürelerin boyutunu azalttı. Tedaviden sonra 7 gün boyunca belirtilen metformin dozları ile elde edilen kürelerin temsili görüntüleri (sağ panel). Küre boyutunun (n≥6) (sol panel) ölçülmesi, apsis ekseninde belirtilen sayılar bireysel tümörü temsil eder. (B) 7 gün boyunca metformin varlığında veya y...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sayma Odası / Hemositometre	Hausser Bilimsel Co	3200
Proliferasyon ve canlılık ölçümü için CASY Hücre Sayacı ve Analizörü	Roche İnovasyon A.Ş.	AG CASY Model TTC 45,60,150 μm
GentleMACS Ayrıştırıcı	Miltenyi Co	130-093-235
GentleMACS C Tüpleri	Miltenyi Co	130-093-237
100 mm'lik doku kültürü kapları	BD Şahin	353803
Hücre süzgeci	BD Şahin	352350
15 ml polipropilen konik boru	BD Şahin	352097
50 ml polipropilen konik boru	BD Şahin	352070
1,5 ml steril tüpler	Eppendorf Belediyesi	0030 120.086
50 ml santrifüj tüpleri	Corning	430828
Steril petri kapları, 10 cm'lik tabaklar	Corning	353003
Kollajenaz tip IV	Kök Hücre Teknolojileri	7909
RPMI Orta 1640	Yaşam teknolojileri	11875-085
Penisilin / Streptomisin çözeltisi, 100X	Yaşam teknolojileri	SV30010
L-glutamin, 200 mM, 100X	Yaşam teknolojileri	25030-081
B27 Takviyesi 50x	Yaşam teknolojileri	17504-044
Temel Fibroblast Büyüme Faktörü	Sigma	F0291
Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle Medium/F12	Sigma	D8437
Steril 1x Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu	Sigma	D8537
Tripan Mavisi	Yaşam teknolojileri	15250-061
CO2 girişli inkübatör
Mikro makas
Kavisli forseps
Kıymık forseps