Küre Oluşum Testi: Pankreas Kanseri Kök Hücrelerini Tanımlamak için İn Vitro Bir Yöntem ve Tarama Tedavileri

1.Küre Şekillendirme Tahlili ve Analizi

1. Küre Oluşumu Testi ve Metformin Tedavisi
   1. Gerekli sayıda hücre alın ve 2.000 hücre / ml'lik bir hücre konsantrasyonu hazırlamak için uygun hacimde CSC ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu 1 saatten fazla buz üzerinde tutmayın ve kaplamadan önce iyice karıştırın.
   2. Ortam buharlaşmasını en aza indirmeye yardımcı olmak için nemlendirme için 24 oyuklu bir plakanın ilk ve son sırasına 500 μl 1X PBS ekleyin. Hücreleri, 1 ml tümör küresi ortamında (2.000 hücre / ml) oyuk başına 2.000 hücre yoğunluğunda ultra düşük bağlı hücre plakalarına tohumlayın.
      not: Tümör küresi oluşturma deneyleri için kullanılan hücre sayısı tümör tipleri arasında farklılık gösterebilir.
   3. Araçla en az 4 kuyu (negatif kontrol) ve tahsis edilen her işlemle 4 kuyu, örneğin 3 mM metformin uygulayın. Hücreleri 37 °C'ye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin ve hücrelere bir hafta boyunca% 5 CO₂ verin.
      not: Tümör kürelerinin bozulmadan oluşumuna izin vermek için ortam değiştirilmemelidir, ancak kültür ortamında stabil olmadıkları için günlük olarak büyüme faktörleri ile doldurulabilir.
   4. Her geçen gün, örneğin kuyucukların her birine 3 mM metformin veya araç gibi tedavi ekleyin. Daha büyük yapıların sayılmasına izin veren otomatik bir hücre sayacı kullanarak 5 ve/veya 7 gün sonra oluşan tümör kürelerinin sayısını değerlendirin (Şekil 1).
      not: Sadece en az 40 μm'lik tümör küreleri düşünülmelidir ve sırasıyla küçük (40 - 80 μm) veya büyük (80 - 120 μm) olarak kategorize edilebilir. Sonuçlar, tümör kürelerinin yüzdesinin tohumlanan ilk hücre sayısına bölünmesiyle gösterilebilir (örneğin, 2.000 hücre).
2. Birinci Nesil Tümör Kürelerinin Seri Geçişi
   1. 7 günlük inkübasyondan sonra, tümör kürelerini 40 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak hasat edin ve RT'de 900 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
   2. Tümör kürelerinin peletini tripsin kullanarak tek hücrelere ayırın ve ardından elde edilen tek hücreli hücre süspansiyonunu 7 gün daha genişletin.

Şekil 1. Metformin tedavisi oksijen tüketimini inhibe eder ve ROS üretimini indükler. (A) Metformin ilavesi, küre türevli hücrelerin oksijen tüketimini (OCR) inhibe eder. İki farklı PDAC sekonder küre metformin ile tedavi edildi ve OCR değişiklikleri ekstrasellüler akı analizi ile ölçüldü. Rotenon enjeksiyonu, toplam mitokondriyal OCR tüketimi için bir kontrol olarak kullanıldı. X ekseni, her bir oyuktaki protein içeriği ile normalize edilen oksijen/saat pmol cinsinden oksijen tüketim oranını temsil eder. (B) A'da kullanılan PDAC küreleri 8 saat boyunca metformin ile muamele edildi ve ROS üretimi karboksi-DCFDA kullanılarak akış sitometrisi ile değerlendirildi. Sol, temsili akış sitometrisi grafikleri. Doğru, üç bağımsız deneyden elde edilen verilerin özeti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.