1. ECM'ye Gömülü 3D Tümör Sferoidlerinin Hazırlanması
- Laminer akış başlığı içinde gerekli malzemeleri içeren bir iş istasyonu hazırlayın.
- 25 kısım steril suya 2 kısım stok probu (%2 katılar) ekleyerek karboksilat ile modifiye edilmiş 1 μm çapında floresan izleyici probların seyreltilmiş bir karışımını hazırlayın.
- Buzdolabından bir şişe 3.1 mg / ml sığır kollajeni çıkarın ve buzun üzerine koyun.
- 125 μl kolajeni 2 ml'lik boş bir şişeye alikot edin.
- Kollajen içeren şişeye 50 μl seyreltilmiş izleyici prob çözeltisi ekleyin ve probları dağıtmak için kısa bir süre girdap yapın.
- Toplam 410 ml'lik bir hacim için fenol kırmızısı (sararacak) içeren 235 μl uygun hücre kültürü ortamı ekleyin ve 205 ml'yi (toplam hacmin yarısı) çıkarmadan ve yeni bir 2 ml'lik şişeye yerleştirmeden önce kısa bir süre vorteksleyin. Flakon 1, tümör sferoidini içerecek ve Flakon 2 bir kontrol karışımı olacaktır.
- Çözeltiyi nötr pH'a geri getirmek için Flakon 1'e ~ 2 μl 1 M NaOH ekleyin (fenol kırmızısı içeren kültür ortamı kırmızıya dönmelidir). Bunun, karışımın buz üzerinde tutulmaması durumunda kürlenmeye başlamasına neden olacağını unutmayın. Karıştırmak için kısa bir süre girdap yapın, ardından hemen buz rafına geri dönün.
not: Sferoid, 9 günlük kültürden sonra çıplak gözle zar zor görülebilir ve agaroz yatağından çıkarılması hassas bir iştir. Diseksiyon mikroskobu kullanımı bazı kullanıcılar için yararlı olabilir. Aktarım sırasında sferoidin bütünlüğünün korunması çok önemlidir.
- Geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak, tümör sferoidini içeren kuyucuktan 40 μl besiyerini nazikçe çıkarın. Bir sonraki adımı gerçekleştirirken bu 40 μl'yi koruyun.
- Önceki adımda sferoidin çıkarılıp çıkarılmadığını görmek için kuyuyu kontrol edin. Eğer öyleyse, sferoid içeren 40 μl'yi Flakon 1'e ekleyin. Değilse, 40 μl'yi tekrar kuyuya yerleştirin ve önceki adımı tekrarlayın.
- Karışımı 60 μl'lik porsiyonlar halinde 96 oyuklu bir plakanın üç ayrı kuyusuna aktarmadan önce Flakon 1'i hafifçe karıştırın (girdap riski taşımayın, küreye zarar verebilir). Hangi kuyucuğun sferoid içerdiğini belirlemek için karışımı ekledikten sonra her bir kuyucuğu mikroskopla inceleyin.
- Flakon 2'ye ~ 2 μl 1 M NaOH ve 40 μl hücre kültürü ortamı ekleyin ve bu karışımın 60 μl'sini 96 oyuklu plakadaki boş bir kuyuya alikotlamadan ve kontrol olarak etiketlemeden önce girdap yapın.
- Plakayı en az 1 saat kürlenmesi için 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
2. Örnek noktalardan oluşan bir ızgara oluşturun ve her noktada bir video çekin
- Numune plakasını inkübatörden mikroskop aşamasına aktarın. Isıtılmış bir aşama mevcut değilse, numunenin oda sıcaklığıyla dengelenmesi için 10 dakika bekleyin.
- Sağlam ve görüntülemeye hazır olduğundan emin olmak için numuneyi düşük güçlü objektif lensleriyle gözlemleyin. Kuyu içindeki tümör pozisyonunu belirleyin.
- Kaç tane numune noktası alacağınıza karar verin. Tipik olarak, her bir oyukta, sferoid etrafında eşmerkezli halkalar halinde dağıtılan 20 numune noktası, yeterince ayrıntılı sonuçlar üretecektir.
- Sahneyi istenen her konuma taşıyın ve x ve y koordinatlarını kaydetmek için mikroskop arabirim yazılımını kullanın (veya arabirim yazılımı yoksa koordinatları manuel olarak kaydedin).
- Mikroskobu yüksek güçlü bir objektif merceğe (tipik olarak 100X) geçirin ve izleyici probların uyarma dalga boyu için uygun filtre küpünü seçin. Kılavuzdaki ilk noktaya gitmek için adım 2.4'te oluşturulan noktaların listesini kullanın.
- Kuyunun dibini bulmak için odağı ayarlayın, ardından birkaç odak içi izleyici probu içeren bir görüş alanı (fov) bulmak için yukarı hareket edin.
- Yoğunluk histogramını gözlemleyin ve görüntünün doygun hale gelmemesini sağlarken mümkün olan en yüksek dinamik aralığı vermek için pozlama yoğunluğunu ve süresini ayarlayın.
- Kare başına 20-30 msn kare hızında bir video dizisi elde edin (her uzamsal ızgara noktasında çekim süresini en aza indirme ihtiyacıyla dengelenmiş sağlam MSD hesaplaması için yeterli istatistikleri sağlamak üzere yaklaşık 800 kare veya 16-24 saniye uzunluk önerilir) ve uygun bir kuralla kaydedin. Kayıt sırasında mikroskoba veya masaya dokunmayın.
- Izgaradaki her örnek noktası için 2.6 ila 2.9 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Deneydeki her kuyucuk için 2.3 ila 2.10 arasındaki adımları tekrarlayın.
