1. Hücre kültürünün hazırlanması ve deney düzeneği
- İnsan kolon kanseri hücrelerini, tedarikçi tarafından önerildiği şekilde HCT-116'yı, %10 fetal sığır serumu ve %1 antibiyotik antimikotik solüsyonu ile desteklenmiş, 10 mL formüle edilmiş McCoy's 5a Orta Modifiyeli içeren 75 cm'lik 2 kültür şişelerinde tek tabakalarda muhafaza edin.
- Hücreleri nemlendirilmiş% 5 CO2 ortamında 37 ° C'de% 70 birleşene kadar% 2 ila 3 günde bir orta yenileme ile büyütün.
- BNCT ışını (örneğin, nötron ışını artı BPA) ve kanser hücrelerini ağır parçacıklar olarak öldürmenin BNCT etkisini elde etmek ve enerjilerinin çoğunu bor içeren kanser hücreleri içinde biriktirmek için, ışınlamadan bir gün önce, hücre kültürü ortamına bor dağıtım maddesi ekleyin - örneğin, 10BPA, 4-Borono-L-fenilalanin (10 μg 10B / mL, 0.925 mM final) Işınlamadan 12–16 saat (maksimum bor alımı) önce.
not: BNCT çalışması durumunda veri bulunmayan başka bir hücre hattı kullanılıyorsa, optimum bor konsantrasyonunu elde etmek için her hücre hattı için bor alımını test edin. Dagrosa grubu tarafından gerçekleştirilen endüktif olarak eşleştirilmiş plazma optik emisyon spektroskopisi (ICP-OES) ile BPA hücresel alımını ölçün.
- 12-16 saat bor dağıtımından sonra, ortamı aspire edin ve hücreleri 10 mL 1x PBS ile yıkayın. Daha sonra hücrelere 2 mL Tripsin-EDTA çözeltisi ekleyerek hücreleri tripsinize edin ve hücre ayrılmasını arttırmak için 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Hücreler ayrılmaya başladığında, 10 mL tam ortam ekleyerek tripsin etkisini durdurun.
- Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik tüpte aspire edin ve 10 μL hücreye 10 μL% 0.4 tripan mavisi ekleyerek, karıştırarak ve bir sayma slaytı üzerinde 10 μL'yi alıntılayarak otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Hücre süspansiyonunu ortamın 1 x 106 hücre / mL konsantrasyonuna seyreltin. Kriyotüp başına 1 mL hücre süspansiyonunun alikot.
- Gama ışını dozlarının ölçümü için termolüminesan dozimetreler (TLD'ler) ve nötron akışları için altın folyolar hazırlayın ve ışınlamadan önce TLD'leri kriyotüplere veya hücre kültürü şişesine takın.
- 1 x 106 hücre/mL'yi, tesis özelliklerine bağlı olarak kültür şişelerinde veya kriyotüplerde 5.9 x 1011 (n/cm-2 dk-1)4 önerilen minimum termal nötron akısı ile nötron karışımlı ışınla ışınlayın.
not: Önerilen nötron akısını elde etmek için önce ışınlama zamanını ayarlayın.
- Işınlamadan sonra, 35 mm Petri kaplarında veya 6 oyuklu plakalarda 22 x 22 mm'lik lameller üzerine 1 mL ışınlanmış hücre (1 x 106 hücre / mL) tohumlayın, 2 mL gerekli ortamla destekleyin. Hücreleri, lamellere yapışmalarını sağlamak için nemlendirilmiş% 5 CO2 ortamında 37 ° C'de maksimum 3 saat inkübe edin. 20x objektif ile ters çevrilmiş bir mikroskop altında zaman zaman hücrelerin bağlanmasını gözlemleyin.
not: HCT-116 hücreleri için minimum yoğunluk tohum için 600.000 hücredir. Hızlı bir boyama prosedürü için, hazne kızakları kullanın, hücre yoğunluğunu buna göre azaltın.
2. Hücrelerin sabitlenmesi
- Hücrelerin ışınlanması ve inkübasyonundan sonra, ortamı bağlı hücrelerden çıkarın ve hücreleri bir kez 2.5 mL PBS ile yıkayın.
- Hücreleri 1 mL% 70 etanol ile RT.
'de 10 dakika boyunca sabitleyin
not: Alternatif olarak, daha önce önerildiği gibi fiksasyon için %1-3.7 paraformaldehit (PFA) kullanın. Protokol burada duraklatılmıştır. Daha fazla analiz ve immünofloresan boyama için sabit hücreleri etanolde -20 ° C'de birkaç haftadan fazla olmamak üzere bir dondurucuda saklayın.
3. Hücrelerin geçirgenliği
- Fiksasyondan sonra, etanolü Petri kabından çıkarın ve 2,5 mL 1x PBS.
ile yıkayın
not: Durulama adımları arasında hücrelerin kurumasına izin vermeyin.
- Lamelleri Petri kaplarındaki hücrelerle kaplamak için nazikçe 1 mL %0.2 Triton X-100/PBS ekleyin.
- RT'de 5 dakika inkübe edin.
- Hücreleri 3 kez 2,5 mL 1x PBS.
ile yıkayın
not: Gerekirse PBS'deki Triton X-100 yüzdesini %0,5'e kadar artırın (test edilen hücre hattına bağlı olarak daha fazla odak tespit edilebilir). Belirsiz bağlamayı önlemek için PBST (%0,5 Tween ile PBS) ile ek yıkamalar yapın.
- PBS'de seyreltilmiş 1 mL% 2 BSA (Sığır Serum Fraksiyonu V albümini) ile geçirgenlik aşamasını bloke edin ve% 1 BSA.
ile en az 30 dakika veya 1 saat inkübe edin
not: Bu adım atlanabilir ve kullanılan antikor tipine bağlıdır. Alternatif olarak, önerildiği gibi %5 FBS kullanın.
4. İmmünofloresan boyama
- PBS'de BSA (% 2 Sığır Serum Fraksiyonu V albümini) ile seyreltilmiş uygun miktarda primer antikor (Anti-ɣ-H2AX, Anti-DNA-PKcs ve Anti-Rad52) önerildiği gibi ekleyin (önerilen seyreltmelerle Tablo 1'e bakınız) (örnek başına 100 μL gereklidir).
| Birincil antikor | fonksiyon | Önerilen seyreltme | Depolama [°C] |
| Anti-ɣ-H2AX | DNA-DSB'lerin tespiti | 1:1000 (PBS-BSA) | 4 |
| Anti-DNA-PKcs | NHEJ'ye ait DNA-PKcs proteininin RIF'lerinin tespiti | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Anti-Rad52 | HRR'ye ait Rad52 proteininin RIF'lerinin tespiti | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| İkincil antikor | | Habersiz | |
| anti-fare IgG FITC | ɣ-H2AX odakları | 1:400 (PBS-BSA) | 4 |
| Keçi Anti-Tavşan IgG H & L (Alexa Fluor 488) | NHEJ ve HRR onarım proteinleri odakları için | 1:500 (PBS-BSA) | -20 |
Tablo 1: Bölümde kullanılan antikorların kullanımı için önerilen dilüsyonlar ve notlar
- Damıtılmış su kullanarak nemlendirilmiş lignin içeren plastik bir kutuda nemi korumak için Petri kabını örtün ve inkübatörde 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
not: Protokol buradan duraklatılabilir. İnkübasyon gece boyunca 4 °C'de yapılabilir.
- İnkübasyondan sonra, 2,5 mL PBS.
ile 3 yıkama yapın
not: Durulama adımları sırasında sürgünün kurumasına izin vermeyin.
- Uygun miktarda ikincil antikor ekleyin (PBS'de BSA ile seyreltilmiş anti-fare IgG FITC, Keçi Anti-Tavşan IgG (Alexa Fluor 488) (bakınız Tablo 1) (numune başına 100 μL gereklidir). Bu ve sonraki adımlar için karanlıkta çalışın.
- Nemi korumak için nemli lignin içeren plastik bir kutuda Petri kabını tekrar kapatın ve inkübatörde 37 °C'de en az 30 dakika inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, 2.5 mL PBS ile 3 yıkama yapın.
- Çekirdekleri lekelemek için PBS'de seyreltilmiş 100 μL DAPI'yi 1 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.
- RT'de en fazla 2 dakika kısa bir süre inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, 2.5 mL PBS ile 3 yıkama yapın.
- PBS'yi çıkarın ve hava kabarcıklarının oluşmasını önleyerek montaj ortamının üstüne nazikçe bir lamel koyun ve lamel kenarlarını oje ile kapatın. Vernik kuruyana kadar bekleyin ve lameli boyayın.
- Floresan mikroskobu altında görüntü analizinden önce montaj ortamının sertleşmesini bekleyin (3 saate kadar).
not: Protokol buradan duraklatılabilir. Cam slaytları karanlıkta 4 °C'de plastik bir kutuda saklayın.
