DCFH-DA Boyama ile ROS Tespiti: Kolorektal Kanser Hücre Hatlarında Toplam ROS Ölçümü

Özet

Kaynak: Kim, H., et al. Yapışık Hücrelerde Toplam Reaktif Oksijen Türlerinin 2',7'-Diklorodihidrofloresein Diasetat Boyama ile Tespiti. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu video, 2',7'-diklorodihidrofloresein diasetat (DCFH-DA) kullanarak toplam hücresel reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etme protokolünü açıklar. Bu yöntem, bir floresan mikroskobu kullanarak yapışık hücrelerde ROS lokalizasyonunu görselleştirmeye ve bir floresan plaka okuyucu ile ROS yoğunluğunu daha da ölçmeye yardımcı olur.

Protokol

1. Hücre tohumlama

1. 24 oyuklu bir plakada oyuk başına 2 x 10⁵ HCT116 kolorektal kanser hücrelerini tohumlayın ve hücreleri Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) gece boyunca 37 ° C'de tutun.
2. Kültür ortamını 100 μM demir sülfat (FS) veya 10 μM doksorubisin (DOX) içeren ortam olsun veya olmasın değiştirin ve 24 saat inkübe edin.

2. DCFH-DA çözeltisinin hazırlanması

1. 10 mM'lik bir stok çözeltisi yapmak için 4.85 mg DCFH-DA'yı 1 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözün
.
2. Stok çözeltisini kuyucuklara eklemeden hemen önce önceden ısıtılmış DMEM ile 10 μM'lik bir çalışma çözeltisine seyreltin.
3. Çalışma çözümünü 10 saniye boyunca girdaplayın.

>3. DCFH-DA boyama

1. İlaç içeren ortamı çıkarın ve bir kez DMEM ile yıkayın.
2. Her kuyucuğa 500 μL DCFH-DA çalışma solüsyonu ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
3. DCFH-DA çalışma çözümünü çıkarın. Bir kez DMEM ile ve 2 kez 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
4. Her kuyucuğa 500 μL 1x PBS ekleyin.

4. Görüntüleme alımı ve yoğunluk ölçümü

1. Bir floresan mikroskobunda yeşil floresan protein (GFP) kanalını kullanarak her kuyucuk için temsili floresan görüntüler alın.
2. Görüntüleri çektikten sonra, PBS'yi çıkarın ve her oyuğa 200 μL radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) tamponu ekleyin.
3. Buz üzerinde 5 dakika inkübe edin, daha sonra hücre lizatını 1,5 mL'lik tüplere toplayın.
4. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 21.130 x g'da santrifüjleyin.
5. Süpernatanın 100 μL'sini siyah 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve 485 nm'lik bir uyarma dalga boyunda ve 530 nm'lik bir emisyon dalga boyunda bir floresan mikroplaka okuyucu kullanarak floresan yoğunluğunu ölçün.
6. Bradford testini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçmek için süpernatanın 1 μL'sini 100 μL 1x protein tahlil çözeltisi içeren 96 oyuklu berrak bir plakaya aktarın.
7. Floresan yoğunluklarını protein konsantrasyonları ile normalleştirin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2',7'-Diklorofloresein diasetat	Cayman Kimya, Ann Arbor, MI	20656
Doksorubisin hidroklorür	TCI Amerika, Portland, VEYA	D4193-25MG
Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Kartal Ortamı	Corning, Corning, NY	45000-304
Invitrogen EVOS FL Otomatik Görüntüleme Sistemi	Thermo Fisher Bilimsel Waltham, MA	AMAFD1000	veya başka bir floresan mikroskobu
Protein tahlili Bradford çözeltisi	Bio-Rad, Herkül, CA	5000001
SpectraMax M2 Mikroplaka Okuyucu	Moleküler Cihazlar, Radnor, PA	89429-532	veya başka bir floresan mikroplaka okuyucu
Demir Sülfat Heptahidrat	VWR, Radnor, Pensilvanya	97061-542

arası