1. Hücre tohumlama
<ol>
	<li>24 oyuklu bir plakada oyuk başına 2 x 105 HCT116 kolorektal kanser hücrelerini tohumlayın ve hücreleri Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) gece boyunca 37 ° C'de tutun.</li>
	<li>Kültür ortamını 100 μM demir sülfat (FS) veya 10 μM doksorubisin (DOX) içeren ortam olsun veya olmasın değiştirin ve 24 saat inkübe edin.</li>
</ol>
2. DCFH-DA çözeltisinin hazırlanması
<ol>
	<li>10 mM'lik bir stok çözeltisi yapmak için 4.85 mg DCFH-DA'yı 1 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözün</li>.
	<li>Stok çözeltisini kuyucuklara eklemeden hemen önce önceden ısıtılmış DMEM ile 10 μM'lik bir çalışma çözeltisine seyreltin.</li>
	<li>Çalışma çözümünü 10 saniye boyunca girdaplayın.</li>
</ol>

>3. DCFH-DA boyama
<ol>
	<li>İlaç içeren ortamı çıkarın ve bir kez DMEM ile yıkayın.</li>
	<li>Her kuyucuğa 500 μL DCFH-DA çalışma solüsyonu ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>DCFH-DA çalışma çözümünü çıkarın. Bir kez DMEM ile ve 2 kez 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.</li>
	<li>Her kuyucuğa 500 μL 1x PBS ekleyin.</li>
</ol>
4. Görüntüleme alımı ve yoğunluk ölçümü
<ol>
	<li>Bir floresan mikroskobunda yeşil floresan protein (GFP) kanalını kullanarak her kuyucuk için temsili floresan görüntüler alın.</li>
	<li>Görüntüleri çektikten sonra, PBS'yi çıkarın ve her oyuğa 200 μL radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) tamponu ekleyin.</li>
	<li>Buz üzerinde 5 dakika inkübe edin, daha sonra hücre lizatını 1,5 mL'lik tüplere toplayın.</li>
	<li>4 ° C'de 10 dakika boyunca 21.130 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanın 100 μL'sini siyah 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve 485 nm'lik bir uyarma dalga boyunda ve 530 nm'lik bir emisyon dalga boyunda bir floresan mikroplaka okuyucu kullanarak floresan yoğunluğunu ölçün.</li>
	<li>Bradford testini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçmek için süpernatanın 1 μL'sini 100 μL 1x protein tahlil çözeltisi içeren 96 oyuklu berrak bir plakaya aktarın.</li>
	<li>Floresan yoğunluklarını protein konsantrasyonları ile normalleştirin.</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="her zaman">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2',7'-Diklorofloresein diasetat</td>
			<td>Cayman Kimya, Ann Arbor, MI</td>
			<td>20656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doksorubisin hidroklorür</td>
			<td>TCI Amerika, Portland, VEYA</td>
			<td>D4193-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Kartal Ortamı</td>
			<td>Corning, Corning, NY</td>
			<td>45000-304</td> arası
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen EVOS FL Otomatik Görüntüleme Sistemi</td>
			<td>Thermo Fisher Bilimsel Waltham, MA</td>
			<td>AMAFD1000</td>
			<td>veya başka bir floresan mikroskobu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein tahlili Bradford çözeltisi</td>
			<td>Bio-Rad, Herkül, CA</td>
			<td>5000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M2 Mikroplaka Okuyucu</td>
			<td>Moleküler Cihazlar, Radnor, PA</td>
			<td>89429-532</td>
			<td>veya başka bir floresan mikroplaka okuyucu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Demir Sülfat Heptahidrat</td>
			<td>VWR, Radnor, Pensilvanya</td>
			<td>97061-542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dcfh-da boyama ile ros tespiti: kolorektal kanser hücre hatlarında toplam ros Ölçümü

ROS Detection with DCFH-DA Staining: Measuring Total ROS in Colorectal Cancer Cell Lines

Kaynak: Kim, H., et al. <a href="https://www.jove.com/v/60682"> Yapışık Hücrelerde Toplam Reaktif Oksijen Türlerinin 2',7'-Diklorodihidrofloresein Diasetat Boyama ile Tespiti.</a> J. Vis. Uzm. (2020).
Bu video, 2',7'-diklorodihidrofloresein diasetat (DCFH-DA) kullanarak toplam hücresel reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etme protokolünü açıklar. Bu yöntem, bir floresan mikroskobu kullanarak yapışık hücrelerde ROS lokalizasyonunu görselleştirmeye ve bir floresan plaka okuyucu ile ROS yoğunluğunu daha da ölçmeye yardımcı olur.

DCFH-DA Boyama ile ROS Tespiti: Kolorektal Kanser Hücre Hatlarında Toplam ROS Ölçümü

Kaynak: Kim, H., et al.  Yapışık Hücrelerde Toplam Reaktif Oksijen Türlerinin 2',7'-Diklorodihidrofloresein Diasetat Boyama ile Saptanması. J. ...

- Reaktif oksijen türleri, elektronlar elektron taşıma zincirinden sızdığında ağırlıklı olarak mitokondriden üretilir. Bu elektronlar moleküler oksijen ile birleşerek çeşitli reaktif oksijen türlerine veya ROS'a yol açar. Kanser hücrelerinde, reaktif oksijen türlerinin aşırı üretimi vardır. Bu oldukça reaktif ROS molekülleri, hücre içindeki zarlara, proteinlere ve DNA'ya oksidatif olarak zarar verebilir.
Artan ROS seviyeleri, DNA'ya zarar verir ve kanserin ilerlemesine neden olan onkojenik bir sinyal yolunun aktivasyonuna yol açar. Bu nedenle, kanser hücreleri tarafından üretilen reaktif oksijen türlerinin seviyelerini tespit etmek hayati önem taşır.
İnsan kolorektal kanserinden kanser hücrelerini uygun bir kültür ortamında alarak başlayın. Daha sonra, bu hücreleri çok kuyulu bir plakaya tohumlayın ve DCFH-DA çözeltisi ekleyin. Plakayı istenen süre boyunca inkübe edin. DCFH-DA hücre zarını geçer. Hücrenin içine girdikten sonra, DCFH-DA, hücresel bir esteraz enziminin varlığında DCFH'ye dönüşür. Ayrıca, DCFH'nin reaktif oksijen türleri tarafından oksidasyonu yeşil floresan molekülleri verir.
Hücreleri floresan mikroskobu altında gözlemleyin. Yeşil floresan yoğunluğu, hücredeki reaktif oksijen türlerinin seviyesini gösterir. Aşağıdaki protokolde, kolorektal kanser hücrelerindeki reaktif oksijen türlerini boyamak için DCFH-DA boyası kullanıyoruz.
- Hücreleri lekelemek için, ilaç içeren ortamı çıkarın ve bir kez DMEM ile yıkayın. Her bir oyuğa 500 mikrolitre DCFH-DA çalışma çözeltisi ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, DCFH-DA'yı kuyulardan çıkarın ve iki kez DMEM ve bir kez PBS ile yıkayın.
Ardından, her kuyucuğa 500 mikrolitre PBS ekleyin. Hücrelerin temsili görüntülerini almak için floresan mikroskobu üzerindeki yeşil floresan protein kanalını kullanın. Ardından, PBS'yi çıkarın ve her bir oyuğa 200 mikrolitre radyoimmünopresipitasyon tahlil tamponu ekleyin.
Plakayı beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve hücre lizatlarını 1.5 mililitrelik tüplere toplayın. Tüpleri 21.130 x g'da 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanın 100 mikrolitresini 96 oyuklu siyah bir plakaya aktarın. Her bir oyuktaki floresansı ölçmek için 485 nanometre uyarma dalga boyunda ve 530 nanometre emisyon dalga boyunda bir mikroplaka okuyucu kullanın.
Daha sonra, 1 mikrolitre süpernatantı 100 mikrolitre protein tahlil çözeltisi ile 96 oyuklu berrak bir plakaya aktararak protein konsantrasyonunu ölçün. Floresan yoğunluklarını normalleştirmek için protein konsantrasyonlarını kullanın.

ros-detection-with-dcfh-da-staining-measuring-total-ros-colorectal

Research

JoVE Encyclopedia of Experiments

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Colorectal Cancer

Kolorektal Kanser

Assays & techniques

Analizler ve Teknikler

5.7K Görüntüleme. - Reaktif oksijen türleri, elektronlar elektron taşıma zincirinden sızdığında ağırlıklı olarak mitokondriden üretilir. Bu elektronlar moleküler oksijen ile birleşerek çeşitli reaktif oksijen türlerine veya ROS'a yol açar. Kanser hücrelerinde, reaktif oksijen türlerinin aşırı üretimi vardır. Bu oldukça reaktif ROS molekülleri, hücre içindeki zarlara, proteinlere ve DNA'ya oksidatif olarak zarar verebilir. Artan ROS seviyeleri, DNA'ya zarar verir ve kanserin ...

DCFH-DA Boyama ile ROS Tespiti: Kolorektal Kanser Hücre Hatlarında Toplam ROS Ölçümü

Bu makalede

Özet

Protokol

Açıklamalar

Malzemeler

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2',7'-Diklorofloresein diasetat	Cayman Kimya, Ann Arbor, MI	20656
Doksorubisin hidroklorür	TCI Amerika, Portland, VEYA	D4193-25MG
Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Kartal Ortamı	Corning, Corning, NY	45000-304
Invitrogen EVOS FL Otomatik Görüntüleme Sistemi	Thermo Fisher Bilimsel Waltham, MA	AMAFD1000	veya başka bir floresan mikroskobu
Protein tahlili Bradford çözeltisi	Bio-Rad, Herkül, CA	5000001
SpectraMax M2 Mikroplaka Okuyucu	Moleküler Cihazlar, Radnor, PA	89429-532	veya başka bir floresan mikroplaka okuyucu
Demir Sülfat Heptahidrat	VWR, Radnor, Pensilvanya	97061-542