$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Hücre hatlarının kültürlenmesi
- % 5 CO 2 nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu, 2 nM glutamin, 100 U / mL penisilin G ve 100 mg / mL streptomisin ile desteklenmiş tam RPMI-1640 ortamında HK hücrelerini büyütün.
not: HK hücreleri normal insan foliküler dendritik hücreleridir ve in vitro olarak ≤ 15 geçiş için büyütülebilir ve genişletilebilir.
2. Lusiferaz işaretli tümörlerin etiketlenmesi ve zenginleştirilmesi
- Tümörleri doğrudan 6-8 haftalık dişi NOD / SCID farelerinin sol ve sağ tarafına implante edin.
- Dijital kumpas kullanarak tümör büyümesini iki haftada bir ölçün.
- 1 cm çapında, tümörü transdüksiyon yapın. 27 G iğneli 1 cc'lik bir şırınga kullanarak tek bir doz Luc / kırmızı floresan proteini (RFP) -lentivirüs (50 μL / tümör, konsantre yüksek titre lentivirüs stoğundan 1:30 seyreltme) doğrudan tümöre enjekte edin.
not: Hastanın tümörü tipik olarak 1-2 ay içinde 1 cm çapa ulaşır. Bununla birlikte, büyüme oranı son derece değişkendir ve tümör derecesi ve tipi dahil olmak üzere bir dizi faktöre dayanır.
3. CRC fare modeli
- İndüksiyon odasında altı ila sekiz haftalık bir erkek NOD / SCID faresini izofluran (% 100 oksijende% 2.5, 1 L / dak) ile uyuşturun. Sedasyonu bir ayak parmağı tutamıyla onaylayın.
- Anestezi uygulanmış fareyi diseksiyon mikroskobu altında sırtüstü pozisyona getirin, burnunu bir izofluran burun konisine ve ön uzuvlarını stabilite için bantla sabitlediğinizden emin olun.
not: Diseksiyon mikroskobu yerine luplar kullanılabilir. Kuyruğun tabanının altına yerleştirildiğinde görünürlüğü ve açıyı iyileştirmek için küçük bir nesne kullanılabilir ve anüsü yükseltir. Tipik olarak, gazlı bezin küçük bölümleri 1 inç çapında bir silindir şeklinde yuvarlanır.
- Distal anal ve rektal mukozayı ortaya çıkarmak için anal kanalı kavisli yağlanmış künt uçlu forseps ile genişletin. Dışkıyı çıkarın.
- 10 μL lusiferaz etiketli tümör hücrelerini ve HK hücrelerini (tam RPMI ortamında CRC modeli için fare başına 10 μL tümör hücresini yeniden süspanse etmek) anal kanalın 1 ila 2 mm yukarısındaki distal posterior rektal submukozaya enjekte etmek için 50 μL'lik bir cam şırınga üzerinde steril bir 30 G çıkarılabilir iğne kullanın. İğnenin eğimi mukoza ile örtülmelidir. Pelvik boşluğa geçmemeye dikkat edin.
- Fareyi izofluran burun konisinden çıkarın. İşlemi takiben 1 saat boyunca gözlemleyin. Sıkıntı belirtileri arayın, yani kambur, zor nefes alma vb.
4. Biyolüminesan görüntüleme
- Lusiferaz aktivitesi için bir biyolüminesan görüntüleme sistemi kullanarak birincil tümör, karaciğer ve akciğer metastatik yükünü haftalık olarak izleyin.
- Bir fare CRC deneyi edinin ve tartın. İntraperitoneal olarak 150 mg / kg lusiferin enjekte edin ve substratın farenin vücudunda dolaşması için 5 dakika bekleyin.
- Fareyi indüksiyon odasında 1 L / dak% 100 oksijen içinde% 2.5 izofluran ile uyuşturun.
- Fareyi, burnu burun konisine sabitlenmiş şekilde bir BLI Görüntüleme makinesine yerleştirin. Görüntü için pozlama yaparken, ilgilenilen alanın kameraya dönük olduğundan emin olun. CRC enjeksiyonu için, ventral taraf her görüntü için kameraya bakmalıdır. Fareyi sırtüstü pozisyonda görüntüleyin.