$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. huA33-TCO'nun Hazırlanması
NOT: huA33-TCO'nun sentezi daha önce bildirilmiştir. Bununla birlikte, okuyucunun kolaylığı için, burada optimum koşullar için ayarlamalarla çoğaltılmıştır.
- 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 40 mg / mL (0.15 M) konsantrasyonda kuru dimetilformamid (DMF) içinde 125 μL'lik bir (E)-siklookt-4-enil 2,5-diokso-1-pirolidinil karbonat (TCO-NHS) çözeltisi hazırlayın. Bu çözelti, gelecekteki deneylerde kullanılmak üzere -80 ° C'de dondurulabilir ve dondurulabilir.
- Ayrı bir 1.7 mL mikrosantrifüj tüpünde, 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS; 2.7 mM potasyum klorür, 137 mM sodyum klorür ve 11.9 mM potasyum fosfat, pH 7.4) içinde 5 mg / mL huA33 çözeltisi hazırlayın.
- 0.1 M Na2CO3'lük küçük alikotlar (<5 μL) kullanarak, antikor çözeltisinin pH'ını Adım 1.2'den 8.8-9.0'a ayarlayın. PH'ı izlemek için pH kağıdı veya mikroelektrotlu bir pH metre kullanın ve pH'ın 9.0'ı aşmamasına dikkat edin.
- Adım 1.3'te tarif edilen antikor çözeltisine, antikor miktarına göre TCO-NHS'nin 40 molar eşdeğerine karşılık gelen bir hacmi yavaşça ekleyin. Örneğin, çözeltide 5 mg (30 nmol) huA33 varsa, 40 mg / mL (0.15 M) TCO-NHS çözeltisinin 9.0 μL (1.20 μmol) ekleyin.
not: TCO-NHS hidrofobiktir. Antikor çözeltisine eklerken, çökelmeyi önlemek için yavaşça ve çalkalayarak ekleyin. Son reaksiyon çözeltisinde hacimce %10 DMF'yi aşmayın.
- Reaksiyonun 25 ° C'de bir termomikser üzerinde hafif çalkalama (500 rpm) ile 1 saat inkübe etmesine izin verin.
- 1 saat sonra, önceden paketlenmiş tek kullanımlık boyut dışlamalı tuz giderme sütunu kullanarak huA33-TCO immünokonjugatını saflaştırın.
- Depolama sırasında sütunda bulunan tüm koruyucuları çıkarmak için boyut hariç tutma sütununu tedarikçi tarafından açıklandığı şekilde dengeleyin. Tipik bir prosedür, 5x kolonun 5x'in, kolonun hacmine karşılık gelen bir PBS hacmi ile yıkanmasını içerir: 5 x 2,5 mL PBS.
- Reaksiyon karışımını, reaksiyon karışımının hacmini not ederek boyut dışlama sütununa ekleyin.
- Reaksiyon karışımı kolona girdikten sonra, kolona eklenen toplam çözelti hacmini 2,5 mL'ye çıkarmak için uygun miktarda PBS ekleyin. Örneğin, konjugasyon reaksiyonu toplam 1.3 mL'lik bir hacimle sonuçlandıysa, kolona 1.2 mL ek PBS ekleyin.
- Ürünü, eluent.
olarak 2 mL PBS kullanarak toplayın
not: Bu adım, 33 mL PBS, pH 2.4'te nihai yapı huA7.4-TCO'yu verecektir.
- 280 nm dalga boyunu izleyen bir UV-Vis spektrofotometre kullanarak huA33-TCO'nun konsantrasyonunu ölçün. Çoğu IgG için molar sönme katsayısı (ε280) 210.000 M-1 cm-1'dir.
- Daha yüksek konsantrasyonda immünokonjugat içeren bir çözelti isteniyorsa, huA33-TCO çözeltisini, üretici talimatlarına göre 50.000 moleküler ağırlık kesme özelliğine sahip bir santrifüj filtre ünitesi kullanarak konsantre edin.
not: Birçok antikorun konsantrasyon sırasında toplandığı veya çökeldiği bilinmektedir. Bu prosedürü yeni bir antikorla denerken, araştırmacılar literatüre veya söz konusu antikoru kullanma deneyimlerine saygı göstermelidir.
- Tamamlanmış huA33-TCO immünokonjugatını hemen gerekirse karanlıkta 4 ° C'de saklayın. Gelecekte 4 günden fazla kullanılacaksa, karanlıkta -80 °C'de saklayın.
not: Bu, prosedürde kabul edilebilir bir durma noktasıdır. Tamamlanan huA33-TCO immünokonjugat, karanlıkta -80 ° C'de en az 6 ay depolama için stabil olmalıdır.
2. Tz-PEG 7-NHBoc Sentezi
- 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 5 mg tetrazin N-hidroksisüksinimidil esteri (Tz-NHS; 12.6 μmol) 0.15 mL susuz dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözün.
- Ayrı bir 1.7 mL mikrosantrifüj tüpünde, 8 mg Boc korumalı amino PEG polimeri, O- (2-Aminoetil) -O'- [2- (Boc-amino) etil] hekzaetilen glikol (NHBoc-PEG7-NH2; 17.1 μmol) 0.15 mL susuz DMSO'da.
- Tz-NHS çözeltisine 3 μL (21.3 μmol, 1.7 molar eşdeğeri) trietilamin (TEA) ekleyin ve iyice karıştırın.
- Pembe tetrazin çözeltisini Adım 2.2'deki NHBoc-PEG7-NH 2 çözeltisine ekleyin ve reaksiyon karışımını hafif çalkalama ile oda sıcaklığında (RT) 30 dakika inkübe edin.
- 30 dakika sonra, reaksiyon karışımını H2O'da 1: 1 oranında seyreltin ve reaksiyona girmemiş herhangi bir Tz-NHS'yi Tz-PEG 7-NHBoc'tan ayırmak için ters faz C18 yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanarak saflaştırın. Boc koruma grubunun erken çıkarılmasını önlemek için asit içermeyen çözücüler kullanın. Hem Tz-PEG 7-NHBoc hem de Tz-NHS'yi 525 nm.
dalga boyunda izleyin
not: Bekletme süreleri büyük ölçüde her laboratuvarın HPLC ekipmanına (pompalar, kolonlar, borular vb.) bağlıdır ve saflaştırmadan önce uygun kontroller yapılmalıdır. Bununla birlikte, bir örnek vermek gerekirse, 30 dakika boyunca 5:95 MeCN/H2O (her ikisi de herhangi bir katkı maddesi olmadan) ila 95:5 MeCN / H2O'luk bir gradyan, 1 mL / dak'lık bir akış hızı ve analitik 4.6 mm x 250 mm C18 sütunu kullanılırsa, Tz-NHS ve Tz-PEG 7-NHBoc'un tutma süreleri yaklaşık 16 dakika ve 18 dakikadır, sırasıyla.
- Toplanan HPLC eluentini sıvı nitrojen kullanarak dondurun ve şimdi donmuş toplama tüpünü alüminyum folyoya sarın. HPLC mobil fazını çıkarmak için donmuş toplama tüpünü gece boyunca bir liyofilizatör üzerine yerleştirin. Ürün karakteristik parlak pembe bir katı.
olacaktır
not: Sıvı nitrojen mevcut değilse, toplanan HPLC eluentini kuru buzda veya gece boyunca -80 °C'lik bir dondurucuda dondurun.
3. Tz-PEG7-NH 2'nin Sentezi
- Adım 2.6, Tz-PEG 7-NHBoc'taki ürüne 1.5 mL diklorometan (DCM) ekleyin ve bu çözeltiyi küçük yuvarlak tabanlı bir şişeye aktarın.
- Adım 3.1'deki pembe çözeltiye damla damla 0.25 mL trifloroasetik asit (TFA) ekleyin.
- Reaksiyonun hafif çalkalama ile RT'de 30 dakika inkübe etmesine izin verin.
- 30 dakika sonra, çözücüyü döner buharlaştırma yoluyla buharlaştırın. 37 °C'lik su banyosu sıcaklığını aşmayın.
- Pembe viskoz ürünü 0,5 mL su içinde sulandırın.
- Tz-PEG18-NH 7'yi Boc korumalı öncüden ayırmak için ters fazlı C2 HPLC kullanarak ürünü saflaştırın. Hem Tz-PEG 7-NHBoc hem de Tz-PEG 7-NH 2'yi 525 nm.
dalga boyunda izleyin
not: Bekletme süreleri büyük ölçüde her laboratuvarın HPLC ekipmanına (pompalar, kolonlar, borular vb.) bağlıdır ve saflaştırmadan önce uygun kontroller yapılmalıdır. Bununla birlikte, bir örnek sunmak gerekirse, 30 dakika boyunca 5:95 MeCN/H2O (her ikisi de %0,1 TFA ile) ila 95:5 MeCN/H2O gradyanı, 1 mL/dk akış hızı ve analitik 4,6 mm x 250 mm C18 sütunu kullanılırsa, Tz-PEG 7-NHBoc ve Tz-PEG7-NH 2'nin alıkonma süreleri yaklaşık 18 dk ve 13 dk'dır, sırasıyla.
- Toplanan HPLC eluentini sıvı nitrojen kullanarak dondurun ve şimdi donmuş toplama tüpünü alüminyum folyoya sarın. HPLC mobil fazını çıkarmak için donmuş toplama tüpünü gece boyunca bir liyofilizatör üzerine yerleştirin. Ürün parlak pembe bir katı olacaktır.
- Ürünü Adım 3.7, Tz-PEG7-NH 2'den 150 μL DMSO ile sulandırın ve 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- 525 nm dalga boyunu izleyen bir UV-Vis spektrofotometre kullanarak Tz-PEG7-NH 2 konsantrasyonunu ölçün. Tz-PEG7-NH 2 (ε525) için molar sönme katsayısı 535 M-1 cm-1'dir.
4. Tz-PEG 7-DOTA'nın Sentezi
- Tz-PEG 7-NH2'yi (4.5 mg, 6.9 μmol) 0.15 mL DMSO'da çözün (veya Adım 3.8'de oluşturulan çözelti ile devam edin).
- Adım 4.1'den tetrazin içeren çözeltiye 22 molar eşdeğer TEA (21 μL, 0.15 mmol) ekleyin.
- Katı olarak 10 mg (14.2 μmol) p-SCN-Bn-DOTA ekleyin ve çözeltiyi yaklaşık 2 dakika veya malzeme tamamen çözünene kadar girdaplayın.
- Reaksiyonun hafif çalkalama ile RT'de 30 dakika inkübe etmesine izin verin.
- 30 dakika sonra, reaksiyonu H2O'da 1: 1 oranında seyreltin ve reaksiyona girmemiş p-SCN-Bn-DOTA'yı çıkarmak için ürünü ters fazlı C 18 HPLC kullanarak saflaştırın. p-SCN-Bn-DOTA 254 nm dalga boyunda izlenebilirken, Tz-PEG7-DOTA en iyi 525 nm dalga boyunda izlenir.
not: Bekletme süreleri açıkça her laboratuvarın HPLC ekipmanına (pompalar, kolonlar, borular vb.) bağlıdır ve saflaştırmadan önce uygun kontroller yapılmalıdır. Bununla birlikte, bir örnek sunmak gerekirse, 30 dakika boyunca 5:95 MeCN/H2O (her ikisi de %0,1 TFA ile) ila 95:5 MeCN/H2O gradyanı ve analitik 4,6 x 250 mm C18 sütunu kullanılırsa, Tz-PEG7-DOTA ve p-SCN-Bn-DOTA sırasıyla yaklaşık 15,6 dk ve 16,1 dk tutma sürelerine sahiptir.
- Toplanan HPLC eluentini sıvı nitrojen kullanarak dondurun ve şimdi donmuş toplama tüpünü alüminyum folyoya sarın. HPLC mobil fazını çıkarmak için donmuş toplama tüpünü gece boyunca bir liyofilizatör üzerine yerleştirin. Ürün parlak pembe bir toz olacaktır.
- Ürünü 0,15 mL DMSO'da sulandırın ve 525 nm dalga boyunu izleyen bir UV-Vis spektrofotometresi kullanarak konsantrasyonu ölçün. Tz-PEG 7-DOTA (ε525) için molar sönme katsayısı 535 M-1 cm-1'dir.
- Sentezin başarılı olduğunu doğrulamak için nihai bileşiği nükleer manyetik rezonans (NMR) ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (HRMS) ile analiz edin. Bu çalışmada tartışılan tüm bileşiklerin deneysel olarak belirlenmiş kimyasal kaymaları ve moleküler ağırlıkları için Tablo 1'e bakınız.
- Saflaştırılmış Tz-PEG7-DOTA solüsyonunu karanlıkta -80 °C.
not: Bu, prosedürde kabul edilebilir bir durma noktasıdır. Tamamlanan Tz-PEG7-DOTA öncüsü, bu koşullar altında en az 1 yıl boyunca stabildir.
5. 177Lu Tz-PEG 7-DOTA'nın Radyo Etiketlemesi
>DİKKAT: Protokolün bu adımı, radyoaktivitenin işlenmesini ve manipüle edilmesini içerir. Bu adımları gerçekleştirmeden veya radyoaktivite ile ilgili başka herhangi bir çalışma yapmadan önce, araştırmacılar kendi kurumlarının Radyasyon Güvenliği Departmanına danışmalıdır. İyonlaştırıcı radyasyona maruz kalmayı en aza indirmek için mümkün olan tüm adımları atın.
NOT: Az miktarda radyometalle çalışırken, koordinasyon bölgesi bağlanmasında paraziti önlemek için tüm tamponların eser metallerden arındırılmış olması önerilir.
- 1.7 mL'lik bir santrifüj tüpünde, 1 M HCl'lik alikotlarla ayarlanmış 200 μL 0.25 M amonyum asetat tamponu ekleyin pH 5.5.
not: Etiketleme için 370 MBq'den daha az aktivite kullanılıyorsa, kullanılan tampon hacmi 100 μL'ye düşürülmelidir.
- Tampon çözeltisine istenen miktarda [177Lu]LuCl3 ekleyin. Eklenen miktar, deneydeki denek sayısına ve uygulanan radyoaktif dozlara bağlı olacaktır. Saflaştırma adımları sırasında potansiyel radyoaktivite kaybını telafi etmek için önlem olarak 1-2 ekstra doz değerinde radyoaktivite eklenmesi önerilir.
- Adım 5.2'deki radyoaktif karışıma DMSO'daki Tz-PEG 7-DOTA'yı ekleyin. Tz-PEG 7-DOTA miktarı, test edilen denek sayısına bağlıdır. Bu konuyla ilgili daha fazla ayrıntı Adım 6.2.2.2'de bulunabilir.
- Solüsyonun 37 °C'de 20 dakika inkübe edilmesine izin verin.
- Mobil faz olarak 50 mM EDTA, pH 5.5 ile radyo anında ince tabaka kromatografisi (radio-iTLC) kullanarak radyo etiketlemenin tamamlandığını doğrulayın. Etiketli [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz taban çizgisinde kalacak - Rf = 0 - serbest [177Lu] Lu3 + EDTA tarafından koordine edilecek ve çözücü cephesi Rf = 1.0 ile hareket edecektir (Şekil 1B).
- Kantitatif etiketleme elde edilemezse, serbest radyometali koordine etmek için ligandlar ekleyin. Alternatif olarak, etiketli [177Lu]Lu-DOTA-PEG 7-Tz'yi bir C18 kartuşu kullanarak saflaştırın. Kullanım için üreticinin talimatlarına uyun. Aşağıda örnek bir prosedür verilmiştir.
- Büyük bir şırınga ile kartuştan 5 mL etanolü yavaşça geçirerek kartuşu doldurun. Daha sonra 5 mL asetonitril ve ardından 5 mL deiyonize (DI) H2O'dan geçirin.
- Adım 5.3'teki radioligand solüsyonunu daha küçük bir şırınga içinde çekin ve yavaşça C18 kartuşuna enjekte edin. Ardından, bağlanmamış [177Lu]LuCl3'ü çıkarmak için kartuşu 10 mL DI H2O ile yıkayın.
- 500 μL etanol ile elute. 10-15 dakika boyunca düşük bir kuru nitrojen veya argon akış hızına sahip kabın üzerinden geçirerek nihai üründen herhangi bir etanolü çıkarın. Daha sonra, radyoligandı Adım 6.2.2.2'de belirlenen bir hacimde salin içinde yeniden süspanse edin.
6. İn vivo Çalışmalar
DİKKAT: Bölüm 5'te olduğu gibi, protokolün bu adımı radyoaktivitenin ele alınmasını ve manipüle edilmesini içerir. Bu adımları gerçekleştirmeden önce, araştırmacılar kendi kurumlarının Radyasyon Güvenliği Departmanına danışmalıdır. İyonlaştırıcı radyasyona maruz kalmayı en aza indirmek için mümkün olan tüm adımları atın.
- Hayvanların hazırlanması
- Dişi atimik çıplak farelerde, 150 μL'lik 1: 1 hücre ortamı ve matris karışımı (örneğin, Matrigel) içinde süspanse edilmiş 5 x 106 SW1222 kolorektal kanser hücrelerini deri altına implante edin ve bunların 100-150 mm'lik bir3 ksenogrefte (aşılamadan 14-18 gün sonra) büyümesine izin verin
.
- Bir biyodağıtım deneyi için hayvanların sınıflandırılması
- Tümörler, kaliper ölçümü ile belirlenen yeterli büyüklükte olduğunda, her kohortun yaklaşık olarak aynı ortalama tümör hacmine sahip olduğundan emin olmak için hayvanları sıralayın. Hayvanlar, her kafeste kuyruk üzerindeki silinmez mürekkeple (bir bant, iki bant vb.) işaretlerle ayırt edilebilir.
- Uzunlamasına bir terapi çalışması için hayvanların sınıflandırılması
- Tümörler, kaliper ölçümü ile belirlenen yeterli büyüklükte olduğunda, deney boyunca doğru izlemeyi sağlamak için hayvanların her birine kulak küpesi takın.
not: Sayısal kulak küpeleri deney boyunca düşebilir. Sonuç olarak, bu fiziksel etiketlere sistematik bir şekilde kulak çentikleriyle eşlik edilmesi önerilir (yani sağ, sol, iki taraflı, sağ x 2, sol x 2).
- Hayvanları, her kohorttaki ortalama tümör hacmi kabaca eşit olacak şekilde sıralayın. Hayvan ayıklama için aşağıdaki yöntem, bir elektronik tablo programı kullanılarak gerçekleştirilebilir.
- Hayvan kimlik numaralarını, kulak çentiği desenini ve tümör hacmini üç ayrı sütunda listeleyin.
- Verileri en küçüğünden en büyüğüne doğru sıralayın.
- Dördüncü sütunda, her hayvana bir kafes numarası atayın ve kafesler arasında yılan benzeri bir şekilde dolaşın. Örneğin, 5 kafes varsa, bu sütun tüm hayvanlara bir kafes atanana kadar "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..." doldurulur.
- Kafesler atandıktan sonra, verileri kafes numarasına göre sıralayın. Kulak çentikleri kullanılıyorsa, belirli bir kafesteki her hayvanın benzersiz bir kulak çentiği desenine sahip olduğundan emin olun. Belirli bir kafeste kopyalar (aynı desenden iki veya daha fazla) varsa, her kafeste benzersiz kulak çentiği desenlerine sahip hayvanlar olana kadar bir fareyi eksik desene sahip başka bir kafesten biriyle değiştirin.
- Formülasyonlar ve Enjeksiyonlar
not: Hem biyodağıtım hem de tedavi çalışması için enjeksiyon sırası şu şekilde ilerler: önce huA33-TCO enjekte edilir, ardından önceden belirlenmiş bir aralıktan sonra [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz enjekte edilir.
- İmmünkonjugat
- HuA33-TCO çözeltisinin bir alikotunu Adım 1.9'dan %0.9 steril salin içinde 0.8 mg / mL konsantrasyona seyreltin.
- PBS'de% 1 sığır serum albümini (BSA) ile ön işleme tabi tutulmuş şırıngalarda 150 μL (100 μg) huA33-TCO çözeltisi dozları çizin ve bu şırıngaları buz üzerinde saklayın.
not: BSA tedavisi, antikorun şırınganın duvarlarına spesifik olmayan bağlanmasını azaltır.
- Kuyruk damarını genişletmek için hayvanı bir ısı lambası altında 3 dakika ısıtın.
- HuA33-TCO solüsyonunu ksenogreft taşıyan farenin kuyruk damarına enjekte edin. HuA33-TCO'nun farenin tümöründe birikmesi için 24 saat (veya önceden belirlenmiş farklı bir zaman aralığı) bekleyin.
- Radyo ligandı
- Bölüm7'te belirtildiği gibi Tz-PEG 5-DOTA radyo etiketi.
- Uygulanan huA33-TCO miktarına göre 1.1 molar eşdeğer Tz-PEG 7-DOTA içeren 150 μL% 0.9 steril salin dozları çizin. Örnek olarak, hayvana 100 μg (0.67 nmol) huA33-TCO enjekte edildiyse ve [177Lu] Lu-DOTA-PEG7-Tz reaksiyon karışımı 12.4 GBq / μmol'lük spesifik bir aktivite ile yapıldıysa, her biri 9.14 MBq aktivite içeren dozlar çizilecektir. Bu, 0.74 nmol Tz'ye karşılık gelir (huA33-TCO'ya göre 1.1 molar eşitlik).
- Kuyruk damarını genişletmek için hayvanları bir ısı lambası altında 3 dakika ısıtın.
- Radyoligand dozunu, ksenogreft taşıyan farenin kuyruk damarına enjekte edin. Enjekte edilecek aktivite miktarı araştırmacı tarafından belirlenir. Yayınlanan veriler, tümör boyutu üzerinde 7.4 - 55.5 MBq aralığında doza bağlı terapötik etkiler göstermiştir.
