Dolaşımdaki miRNA Ekstraksiyonu: Organik Ekstraksiyon ve Küçük RNA Zenginleştirme Yoluyla Plazma Örneklerinden miRNA'yı İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Abstract

Kaynak: Canale, M. ve ark., Metastatik Kolorektal Kanserli Hastalarda Dolaşımdaki MicroRNA Özel Panelinin Tespiti. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu videoda, organik ekstraksiyon kullanılarak kolorektal kanser hastalarının plazma örneklerinden dolaşımdaki mikroRNA'nın ekstraksiyonu ve ardından cam elyaf kolon zenginleştirme işlemi açıklanmaktadır. miRNA'lar serum ve plazma gibi biyolojik sıvılarda stabildir, bu da onları kanser teşhisi, prognozu ve tedavi kararı verme ve izleme için ideal dolaşımdaki biyobelirteçler haline getirir. Bu yöntem, hastalarda klinik sonuçları tahmin edebilen yeni dolaşımdaki biyobelirteçlerin tanımlanmasına yardımcı olacaktır.

Protocol

>NOT: Aşağıdaki adımların tümünü İyi Laboratuvar Uygulamalarına (GLP) göre sterilize edilmiş bir çeker ocak altında gerçekleştirin.

1. Plazma Toplama ve Depolama

1. Bir K3E EDTA tüpünde 3 mL periferik kan örneği toplayın.
2. Tüpü oda sıcaklığında 1.880 x g'da 15 dakika santrifüjleyin.
3. Süpernatan plazmayı 450 μL'lik alikotlarda geri kazanın.
4. Numuneleri kullanılana kadar -80 °C'de saklayın.
   NOT: Periferik kan tüpünü alındıktan sonra 2 saat içinde işleyin. Plazmayı tüpten geri kazanırken, lenfosit tabakasını rahatsız etmeyin.

2. Plazma Örneklerinden Dolaşımdaki miRNA'ların Ekstraksiyonu

1. Gerekli tüm çözeltileri hazırlayın ve ekstraksiyon adımları için numuneleri çözün.
   1. 2x denatüre edici çözeltiye 375 μL 2-merkaptoetanol ekleyin ve iyice karıştırın.
   2. MiRNA yıkama çözeltisi I'e 21 mL ACS derece %100 etanol ekleyin ve iyice karıştırın.
   3. Yıkama solüsyonuna 2/3 oranında 40 mL ACS sınıfı %100 etanol ekleyin ve iyice karıştırın.
   4. Bir plazma alikotunun oda sıcaklığında çözülmesine izin verin ve ardından ekstraksiyon adımlarına başlayın.

2. Organik ekstraksiyon
   1. Plazma örneğinin 400 μL'sini RNaz içermeyen 2 mL'lik bir tüpe aktarın.
   2. 400 μL 2x denatüre edici çözelti ekleyin, girdaplama ile karıştırın ve kısaca santrifüjleyin.
   3. 4 μL 1 nM spike-in ekleyin, girdaplama ile karıştırın ve kısaca santrifüjleyin.
   4. 800 μL asit fenol-kloroform ekleyin.
   5. 60 saniye boyunca girdap yapın ve 15 dakika boyunca maksimum hızda (≥10.000 x g) santrifüjleyin.
   6. Üst sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. İnterfazı rahatsız etmeyin. Geri kazanılan hacmi not edin ve susuz fazı içeren tüpü atın.
      not: 2x denatüre edici çözelti 4 °C'de saklanır ve bu sıcaklıkta katılaşabilir. Kullanmadan önce, çözeltiyi 37 ° C'ye ısıtın ve ara sıra 10-15 dakika çalkalayın. Karışımın üstünde bulunan sulu tamponu değil, asit fenol-kloroform içeren alt fazı çekmeye dikkat edin. Elüsyon çözeltisini veya nükleaz içermeyen suyu önceden 95 °C'ye ısıtın. Yeterli hacimde çözeltiyi ısıtmaya dikkat edin (numune başına 100 μL + %10 fazla).

1. Küçük RNA zenginleştirme
   1. Adım 2.2.6'dan itibaren sulu faza 1/3 hacim %100 etanol ekleyin ve iyice karıştırın.
   2. Her numune için yeni bir toplama tüpüne bir filtre kartuşu yerleştirin.
   3. Adım 2.3.1'den 700 μL'ye kadar lizat ve etanolü filtre kartuşuna aktarın ve 30 saniye boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
   4. >700 μL karışım kalmışsa, süzüntüyü yeni bir tüpe koyun ve 2.3.3 adımını tekrarlayın; karışımın tamamı filtre kartuşundan geçene kadar tekrarlayın.
   5. Akışın toplam hacmini ölçün.
   6. Süzmek için 2/3 hacimce %100 etanol ekleyin ve iyice karıştırın.
   7. Yeni bir toplama tüpüne ikinci bir filtre kartuşu yerleştirin.
   8. Kartuşa 700 μL'ye kadar numune hacmini aktarın ve 30 saniye boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Akışı atın.
   9. Tüm karışım filtre kartuşundan geçene kadar 1.3.8 adımını tekrarlayın.
   10. Filtre kartuşuna 700 μL miRNA yıkama solüsyonu 1 uygulayın ve filtre kartuşunu toplama tüpü ile 10,000 x g'da 15 saniye boyunca santrifüjleyin. Akışı atın. Filtre kartuşunu aynı toplama tüpüne yerleştirin.
   11. Filtre kartuşuna 500 μL yıkama solüsyonu 2/3 uygulayın ve filtre kartuşunu toplama tüpü ile 15 saniye boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Akışı atın. Filtre kartuşunu yeni bir toplama tüpüne yerleştirin.
   12. Filtre kartuşunu yeni bir toplama tüpüne yerleştirin ve 500 μL yıkama solüsyonu 2/3 ile 2.3.11 adımını tekrarlayın. Akışı atın ve filtre kartuşunu yeni bir toplama tüpüne aktarın.
   13. Tüpleri filtre kartuşları ile 10.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
   14. Filtre kartuşunu 1,5 mL'lik yeni bir toplama tüpüne aktarın ve 100 μL önceden ısıtılmış (95 °C) elüsyon çözeltisi veya nükleaz içermeyen su ekleyin.
   15. MiRNA'ları geri kazanmak ve -80 °C'de saklamak için 30 saniye boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
       not: Yıkama solüsyonu 2/3'te beyaz bir çökelti oluşabilir. Bu çökelti, çözeltiden salınan fazla EDTA'dır. Pipetleme adımları sırasında bu kristalleri çekmekten kaçının.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rnase içermeyen Safe-lock 1,5 mL tüpler	Eppendorf Belediyesi	0030 123.328
Rnaz içermeyen 1000 μL uçlar	Yıldız Laboratuvarı	S1122-1830 Serisi
Rnaz içermeyen Güvenli kilitli 2 mL tüpler	Eppendorf Belediyesi	0030 123.344
Rnaz içermeyen 20 μL uçlar	Yıldız Laboratuvarı	S1123-1810
Rnaz içermeyen 200 μL uçlar	Yıldız Laboratuvarı	S1120-8810
mirVana PARIS RNA ve Doğal Protein Saflaştırma Kiti	Termo Balıkçı	AM1556
% 100 etanol anidrous ACS sınıfı	Carlo Erba Reaktifleri	414605
2-merkapto-etanol	Sigma-Aldrich	M3148
0,2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 μL laboratuvar pipetleri
Çeker ocak
Tezgah üstü mikrosantrifüj
girdap