$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Dışkıdan Genomik DNA İzolasyonu
NOT: Bir dışkı patojeni tespit protokolünü takiben mikrobiyal DNA'yı dışkıdan izole etmek için ticari bir kit kullanın. Numuneleri doğrudan -80 °C dondurucudan çıkarın ve tartılırken kuru buz üzerinde saklayın.
- 220 mg'a kadar dışkıyı, 1.4 mL oda sıcaklığında (RT) dışkı lizis tamponu içeren temiz bir mikrofüj tüpüne aktarın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Katıları iyice homojenize etmek için numuneyi 1 dakika boyunca vorteksleyin (Şekil 1B). Tüm bakterileri (Gram pozitif bakteriler dahil) parçalamak için süspansiyonu 5 dakika boyunca 95 ° C'ye ısıtın.
- Numuneleri 15 saniye vorteksleyin ve ardından dışkı katılarını peletlemek için 20.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 2 mL'lik bir mikrofüj tüpüne aktarın. PCR inhibitörlerini emmek için her numuneye bir tablet ekleyin, tablet eriyene kadar girdap yapın ve numuneyi RT'de 1 dakika inkübe edin.
- Numuneyi 3 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir mikrofüj tüpüne aktarın. 20.000 x g'da 3 dakika santrifüjleyin. 15 μL proteinaz K'yi (20 mg / mL stok) yeni bir 1.5 mL mikrofüj tüpüne alın. Numunenin 200 μL'sini proteinaz K içeren tüpe pipetleyin.
- Tüpe 200 μL guanidinyum klorür lizis tamponu ekleyin, 15 saniye boyunca iyice vorteksleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve numuneyi 70 ° C'de 10 dakika inkübe edin. Tüplere 200 μL etanol (% 96-100) ekleyin ve girdaplama ile iyice karıştırın.
- 2 mL'lik bir toplama tüpüne silika bazlı bir spin sütunu yerleştirin ve numuneleri sütuna uygulayın. Kapağı kapatın ve 20.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
- Kolonu yeni bir 2 mL toplama tüpüne aktarın ve kolona 500 μL yıkama tamponu 1 ekleyin, kolonu kapatın ve 20.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin. Kolonu yeni bir 2 mL toplama tüpüne aktarın ve kolona 500 μL yıkama tamponu 2 ekleyin, Kapağı kapatın ve 20.000 x g'de 3 dakika santrifüjleyin.
- Kapak kapalıyken, sütunu yeni bir 2 mL toplama tüpüne aktarın ve kalan yıkama tamponunu çıkarmak için 20.000 x g'da 1 dakika daha santrifüjleyin. Sütunu 1.5 mL etiketli bir mikrofüj tüpüne aktarın ve membrana EDTA içeren 200 μL elüsyon tamponu ekleyerek numuneyi elüte edin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Kapağı kapatın ve RT'de 1 dakika inkübe edin. Numuneyi 20.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin. Sütunu atın.
2. PCR için DNA Konsantrasyonu Tayini ve Numune Hazırlama
>NOT: Her numunedeki genomik DNA konsantrasyonunu belirlemek için bir florometre ve ticari olarak temin edilebilen bir dsDNA floresan testi kullanın (bkz. Malzeme Tablosu). Floresan boya, çift sarmallı DNA'yı spesifik olarak bağlamalıdır.
- Her numunenin 1:200 seyreltmesini (199 μL dsDNA ana karışımında her numunenin 1 μL'si) ve standartların 1:50 seyreltmesini hazırlayın. dsDNA ayarını kullanarak bir florometre üzerinde analiz edin.
Not: PCR'deki yüksek DNA hacmi inhibitör olabilir, bu nedenle kullanılan DNA hacmi, PCR'nin nihai hacminin %10'undan fazla olmamalıdır. Bir florometre, numunedeki DNA'nın doğru bir şekilde ölçülmesini sağlar, çünkü yalnızca floresan boyaya bağlı DNA floresan yayılır ve kirleticilerin nihai hesaplanan DNA konsantrasyonuna olası katkısını ortadan kaldırır. Bu doğru nicelik belirleme seviyesi, aşağı akış dizileme uygulaması için çok önemlidir.
- Her numunenin çalışma şablonu stoklarını yapmak için uygun hacim 10 mM Tris, pH 8.5 ile 5 ng/μL'ye seyreltilmiş PCR şablonları hazırlayın.
- Numuneleri -20 °C'de saklayın.
3. 16S İstenilen V Bölgelerine Astarlar Tasarlayın
- İstenen V 16S rRNA bölgelerini seçici olarak amplifiye etmek için primerler tasarlayın.
- Çeşitli phyluca.
için yaklaşık isabet oranını belirlemek için Ribozomal Veritabanı Projesi'nden Probe Match ile primerleri analiz edin
Not: V1-V3 bölgeleri için, mevcut çalışmada, V1 bölgesi içinde 8. pozisyonda bağlanan Bosshard forward ve V3 bölgesi içinde 533. pozisyonda bağlanan 533 geri primerleri yayınlanmıştır. Primerler, indeksleme için çıkıntı adaptör dizileri içermelidir.
- Primer tasarlarken, 16S metagenomik dizileme kitaplığı hazırlığı için önerildiği gibi, her primerin 5' ucuna adaptör dizileri ekleyin (Tablo 1).
- Bu büyük astarları kartuş saflaştırması ile sentezleyin. Kurutulmuş primerleri sulandırın ve bir PCR çalışma stoğunu 10 mM Tris, pH 8.5'te 1 μM'ye seyreltin.
4. Çıkıntı Adaptör Dizileri Takılıyken V Bölgelerini Yükseltmek için PCR'yi Yükseltin
- Amplikon PCR reaksiyon karışımını Tablo 2'de açıklandığı gibi ayarlayın.
- Plakaya yapışkan şeffaf bir PCR plakası contası yerleştirin ve Tablo 3'teki parametreleri kullanarak amplikon PCR'yi çalıştırın.
- (İsteğe bağlı) Amplikon PCR ürünlerini, amplikon boyutunun kantitatif ölçümünü sağlayan bir agaroz jel veya yüksek hassasiyetli bir DNA testi üzerinde çalıştırın (bkz. Malzeme Tablosu).
Not: Bu çalışmadan elde edilen amplikon boyutu 550 bp'dir (Şekil 2a).
5. Manyetik Boncuklar Kullanarak PCR Temizleme
- Yoğuşmayı toplamak için amplikon PCR plakasını 1,000 x g'da 1 dakika boyunca hızlı bir şekilde santrifüjleyin.
not: Kontaminasyonu en aza indirmek için PCR plakaları yerine PCR tüp şeritleri kullanılabilir. Tüp kapaklarını atın ve asla tekrar kullanmayın.
- Manyetik boncukları eşit şekilde dağıtmak için girdaplayın ve her amplikon PCR kuyucuğuna 20 μL manyetik boncuk ekleyin, ardından tüm hacmi 10 kez yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin.
- RT'de 5 dakika inkübe edin. PCR plakasını manyetik boncuklar toplanana ve süpernatan berraklaşana kadar 2 dakika manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Süpernatanı çıkarın ve atın.
- PCR plakası manyetik stand üzerindeyken boncukları 200 μL taze %80 etanol ile yıkayın ve manyetik stand üzerinde RT'de 30 saniye inkübe edin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın.
- Yıkamayı ikinci kez tekrarlayın. Şimdi, kuyucuklardan kalan etanolü çıkarmak için ince bir pipet ucu kullanın ve 10 dakika boyunca havayla kurumaya bırakın.
- PCR plakasını manyetik standdan çıkarın ve her oyuğa 52.5 μL 10 mM Tris pH 8.5 ekleyin. Boncukları askıya almak için 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
- Manyetik boncukları toplamak için PCR plakasını manyetik standa aktarın ve 50 μL süpernatanı temiz bir PCR plakasına aktarın. Plakaya yapışkanlı şeffaf bir PCR plaka contası yerleştirin ve -20 °C'de bir haftaya kadar saklayın.
| >Amplicon PCR Primerleri |
| iletmek | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAGagagtttgatcMtggctcag-3' |
| ters | 5'- GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTACCGCGGCTGCTGGCAC -3' |
| Locus'a özgü diziler kalın olarak gösterilir ve kalın olmayan, çıkıntı adaptör dizisidir. |
Tablo 1: Amplikon PCR Primerleri.
| Amplikon PCR reaksiyonu kurulumu | |
| hacim |
| Mikrobiyal DNA (5ng/μl) | 2,5 μl |
| İleri Astar (1 μM; adım 3.1'den itibaren) | 5,0 μl |
| Ters Astar (1 μM; adım 3.1'den itibaren) | 5,0 μl |
| 2X HotStart Hazır Karışım | 12,5 μl |
| toplam | 25,0 μl |
Tablo 2: Amplikon PCR Primerleri.
| >Amplicon PCR kurulumu |
| esnasında 95 3 dakika | |
| 25 Döngü: | |
| esnasında 95 30 °C |
| 30 saniye boyunca 55 °C |
| 60 saniye boyunca 72 °C |
| esnasında 72 3 dakika | |
| 4 °C'de tutun | |
Tablo 3: Amplicon PCR programı kurulumu.
