1. Yapay Hücre Dışı Matriks Üzerinde Kültürlenen CRC Organoidlerinin Üretilmesi
Kolon PDX'lerinin CRC organoid kültürü için deneysel prosedürler Şekil 1B'de özetlenmiştir (adım 4).
- Daha önce insan kolon organoidleri için tarif edilen ortamı kullanarak PDX'ten türetilmiş CRC organoidleri için uygun bir kültür ortamı oluşturun (Malzeme Tablosuna bakınız, "CRC organoid kültür ortamı").
- Buz üzerinde 12 oyuklu bir plaka üzerine oyuk başına 150 μL yapay hücre dışı matris (Malzeme Tablosuna bakınız) uygulayın ve daha sonra jelleri katılaştırmak için 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde 30-60 dakika inkübe edin.
- PDX fare modelinden elde edilen CRC hücrelerinin hücre peletini 3 x 105 hücre / mL'ye ayarlamak için CRC organoid kültür ortamı (adım 1.1'den itibaren) ile %5 FCS ile askıya alın. Daha sonra, ortamın 1 mL'sini adım 1.2'de hazırlanan yapay hücre dışı matris kaplı plakaya tohumlayın ve gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 altında inkübe edin. Hücre süspansiyonundaki tek hücreler ve çok hücreli kümeler (bir grup yapışık hücre) dahil olmak üzere tümör hücrelerinin sayısını saymak için bir hemositometre kullanın.
NOT: Bu çalışmada kollajenazın kalıntı enzimatik aktivitesini söndürmek için %5 FCS kullanılmıştır.
- Yapay hücre dışı matris kaplı plakadan ayrılan yüzen hücreler de dahil olmak üzere kültür ortamını ertesi gün 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne dikkatlice toplayın ve 5 dakika boyunca 1.400 x g'da santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve peleti buz üzerinde 70 μL yapay hücre dışı matris içinde yeniden süspanse edin.
- CRC hücresi canlılığını artırmak için, tümör hücresi içeren yapay hücre dışı matrisi, yapay hücre dışı matris kaplı plakaya bağlı tümör organoid hücrelerinin üzerine yerleştirin ve 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde 30 dakika inkübe edin, yapay hücre dışı matris kaplamasını katılaştırın. Daha sonra, 37 ° C'de% 5 CO2 altında% 1 FCS ile% 1 CRC organoid hücre kültürü ortamı ile inkübe edin.
- Kültür ortamını her iki günde bir değiştirin. CRC organoidleri ortamı doldurduğundan, ortamı günlük olarak değiştirmek gerekebilir.
2. GFP Lentiviral Partiküllerinin Üretilmesi ve Zenginleştirilmesi
GFP lentiviral partiküllerinin üretilmesi ve zenginleştirilmesi için deneysel prosedürler Şekil 1C'de özetlenmiştir (adım 5).
- Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 besiyeri ile %10 FCS içeren hücreleri HEK293T ve aşağıdaki transfeksiyon prosedürü için altı adet 10 cm'lik tabak (tabak başına 2 x 10,6 hücre) hazırlayın.
- Tabak başına transfeksiyon için, bir PRRL-GFP vektörü (5 μg) ve pCMV-VSV-G (1 μg) ve pCMV-dR8.2 dvpr (5 μg) gibi iki lentiviral ambalaj plazmidi ile DMEM'de 20 μL transfeksiyon reaktifi dahil olmak üzere 500 μL karışım hazırlayın, steril bir 1.5 mL mikrotüpte. Karışımı oda sıcaklığında 20 dakika tutun ve ardından 10 cm'lik tabakların her birinin üzerine koyun ve 18 saat inkübe edin.
- Orta maddeyi çıkarın, her yemeğe 5 mL taze %10 FCS-RPMI 1640 orta ekleyin ve 24 saat bekletin.
- Şartlandırılmış ortamı her tabaktan 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın ve toplam 30 mL ortamı gece boyunca 4 °C'de saklayın. Her tabağa 5 mL taze RPMI 1640 ekleyin ve 24 saat bekletin.
- Şartlandırılmış ortamı her tabaktan 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın ve toplamda 30 mL ortamın 30 mL'sini buz üzerinde tutun. Ardından, hücreleri atın.
- Hücreleri çıkarmak için ortamın 60 mL'sini (2.4-2.5 adımlarından itibaren) 0.45 μm'lik bir filtreden süzün ve bu miktarı ultrasantrifüjleme için on iki 5 mL polipropilen santrifüj tüpüne bölün.
- Virüsleri konsantre etmek için, 4 °C'de 1,5 saat boyunca 85.327 x g'da sallanan bir kova rotoru kullanarak santrifüjleyin.
- Ortamı hemen çıkarın. Konsantre virüs peletini çözmek için, on iki tüpün her birine 250 μL Besin Jambon Karışımı F-12 (F12)/DMEM ortamını FCS içermez ve gece boyunca 4 °C'de tutun. Virüs peletinin genellikle görünmez olduğunu unutmayın.
- Toplamda, muhtemelen mL başına 108 dönüştürücü birim (TU/mL) içeren GFP lentiviral partikülleri de dahil olmak üzere, konsantre 5x GFP lentivirüs stoğunun 3 mL'sini toplamak için ortamı nazikçe pipetleyin. Ardından, on iki adet 1,5 mL mikrotüpü (tüp başına 250 μL dahil) steril koşullar altında -80 °C'de bir yıla kadar saklayın. Birden fazla donma-çözülme döngüsünden kaçınmak için orijinal çözeltinin birçok küçük alikotunu hazırlayın.
3. Yapay Hücre Dışı Matriks Üzerinde Kültürlenmiş GFP Lentiviral Partikülleri ile CRC Organoid Hücrelerinin Etiketlenmesi
CRC organoid hücrelerini GFP lentivirus ile etiketlemek için deneysel prosedürler Şekil 1C'de özetlenmiştir (adım 6).
- Adım 1.6'da hazırlanan CRC organoidlerinin 7-10 gün boyunca parazitsiz büyümesine izin verin, steril bir hücre kazıyıcı kullanarak mekanik olarak hasat edin ve 1.5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın.
not: Kültürde CRC organoidlerinin büyümesi, hastalardan alınan orijinal tümörlerin doğasına bağlıdır. CRC organoidlerinin aşırı büyümesini, 1: 2 bölünmüş bir oranda yeni bir yapay hücre dışı matris kaplı 12 oyuklu plakaya aktarmadan önce% 60-70 birleşme noktasında tutarak önleyin.
- Mikrotüpü 1.400 x g'da 3 dakika santrifüjleyin, kültür ortamını çıkarın ve hücre peletini hafifçe vurarak 500 μL PBS'de çözün.
- Mikrotüpü 1.400 x g'da 3 dakika santrifüjleyin ve PBS'yi ortadan kaldırın.
- Yapışan CRC organoidlerini ayırmak için, tüpteki hücre peletine 500 μL'lik bir proteolitik ve kollajenolitik enzim hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve hafifçe vurarak karıştırın. Daha sonra tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika dinlenmeye bırakın.
- Hücreleri kabaca ayırmak için hücre süspansiyonunu 1,5 mL'lik bir mikrotüpte birkaç kez 500 μL ek %1 FCS-DMEM ile çok nazikçe pipetleyin. Sert pipetleme ile CRC organoidlerinden tek hücrelerin oluşturulması, hücre canlılığını önemli ölçüde azaltır. Bu nedenle, 1,5 mL'lik bir mikrotüpte nazikçe pipetleyerek hücre kütlesinin hücre süspansiyonunda görsel olarak tespit edilebilir durumda bırakılması önemlidir.
- Hücre süspansiyonunu 1.400 x g'da 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
- Hücre peletini, 1.5 mL'lik bir mikrotüpte 100 μL 5x GFP lentivirüs stoğu (>108 TU/mL) ve 400 μL CRC organoid kültür ortamının bir karışımı ile 5 x 10 500 μL'lik bir konsantrasyona ayarlamak için hafifçe vurarak çözün500 μL'de 5 ayrışmış tümör hücresi. Tümör hücrelerinin sayısını saymak için bir hemositometre kullanın, yukarıda açıklandığı gibi hücre süspansiyonundaki tek hücreler ve hücre grupları dahil olmak üzere (adım 1.3).
- Adım 1.2'de açıklandığı gibi yapay hücre dışı matris kaplı 12 oyuklu bir plaka hazırlayın. Daha sonra, adım 3.7'de hazırlanan hücre süspansiyonunun 500 μL'sini plakaya yerleştirin ve %5 CO2 altında 37 ° C'de 18 saat bekletin.
- Yapay hücre dışı matris kaplı plakadan ayrılan yüzen hücrelerin bulunduğu ortamı 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın. 1.400 x g'da santrifüjleyin ve ardından süpernatanı çıkarın ve peleti buz üzerinde 70 μL yapay hücre dışı matris içinde yeniden süspanse edin.
- CRC hücresi canlılığını arttırmak için, tümör hücresi içeren yapay hücre dışı matrisi, adım 1.5'te açıklandığı gibi yapay hücre dışı matris kaplı 12 oyuklu plakaya bağlı tümör organoidleri üzerine yerleştirin. Daha sonra, yapay hücre dışı matris kaplamayı katılaştırmak için plakayı 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde 30 dakika inkübe edin ve daha sonra% 5 CO2 altında 37 ° C'de% 1 FCS ile 1 mL CRC organoid kültür ortamı ile kültürleyin.
- Enfeksiyondan üç gün sonra hücreleri floresan mikroskobu altında gözlemleyin ve yüksek titre lentiviral partiküllerin kullanılması nedeniyle neredeyse %100 GFP pozitifliğini doğrulayın (bkz. Şekil 2A).
- Alıcı farelere enjeksiyondan önce hücre büyümesini genişletmek için CRC organoidlerini 7-10 gün boyunca kültürleyin.
