$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Farelerden CRC PDX'lerin diseksiyonu
CRC PDX'lerin diseksiyonu için deneysel prosedürler Şekil 1B'de özetlenmiştir (adım 2).
- Tümörün deri altından ~ 1 cm3 boyutuna kadar büyümesine izin verin, bu genellikle yaklaşık 1-3 ay sürer.
- Küçük hayvan inhalasyon anestezi cihazını kullanarak fareyi izofluran inhalasyonu ile uyuşturun ve cildi% 70 etanol ile dezenfekte edin.
- Fareyi laboratuvar tezgahına yüzüstü pozisyonda yerleştirin. Cildi kesin, tümörü açığa çıkarın ve steril makas kullanarak cildi tümörden dikkatlice ayırın. Tümörü çıkardıktan sonra, 10 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin, tümörden büyük ölçüde nekrotik bölgeleri çıkarın ve ardından 5 mL PBS.
ile iki kez durulayın
not: Nekrotik alanlar genellikle çevredeki alanlardan daha beyaz, daha yumuşak ve daha gevrektir.
- Tümörü buz üzerine yerleştirin ve 1) CRC organoid kültürü, 2) ikincil farelere transplantasyon, 3) histolojik inceleme ve 4) tümör parçalarının dondurulması ve saklanması dahil olmak üzere farklı uygulamalar için en az 4 parçaya eşit olarak bölün.
- CRC organoidlerinin üretilmesi için, katı tümör dokusunu 1 mL steril PBS içeren 6 cm'lik bir petri kabına yerleştirin. İşlemeye kadar dokuyu buz üzerinde tutun.
- İnsan CRC'si için PDX modelini oluşturmak için, yeni CRC PDX'lerini ikincil bir fareye geçirin. Steril tıraş bıçağı kullanarak tümör dokusunu küçük parçalara (5 x 5 x 5 mm,3 boyutunda) kesin ve bu doku parçalarını nazikçe 50 μL yapay hücre dışı matrise daldırın. Daha sonra, bu parçaları NOG faresinin sağ ve sol deri altı ceplerinin alt kısımlarına implante edin.
- Anestezi uygulanmış fareyi laboratuvar tezgahına yüzüstü pozisyonda yerleştirin. Steril makas kullanarak doku implantasyonu için deri altı cepler oluşturmak için alıcı farenin sağ ve sol kanatlarının alt kısımlarında küçük bir kesi yapın. Periton zarını delmemeye dikkat edin. Bu işlemle çok az kanama olmalıdır.
- Yukarıda hazırlanmış tümör parçalarını yavaşça 50 μL yapay hücre dışı matrise batırın ve ardından bunları sağ ve sol deri altı ceplerinin alt kısımlarına implante edin.
- Cerrahi işlem gören farelerde kesiyi yara klipsleri ile dikin. İmplante edilen tümör dokularının cilt altındaki kesiden belirli bir mesafede bulunduğundan emin olun.
not: Cerrahi prosedürlerin en aza indirilmesi açısından, bu çalışmada cerrahi sonrası ağrı ve enfeksiyona yönelik herhangi bir tedavi uygulanmamıştır.
- Fareyi ılık bir pedin üzerine yerleştirin ve yeterli bilinç geri gelene kadar sternal yaslanma pozisyonunu koruyun. Tamamen iyileştikten ve dört ayak üzerinde oturabilecek duruma geldikten sonra, fareler ev kafeslerine geri dönebilir. Avlanmayı önlemek için, aynı kafeste ameliyat edilmeyen hayvanlarla üremeye izin vermeyin.
- Histolojik analiz için, numuneleri 2 gün boyunca oda sıcaklığında 15 mL'lik konik bir tüpte 5 mL% 10 nötr tamponlu formalin içinde sabitleyin.
- Kriyoprezervasyon için, tümör dokusunu küçük parçalar halinde kesin (5 x 5 x 5 mm3 boyutunda) ve numuneleri 1-1.5 mL kriyoviyal tüplerde 500 μL hücre dondurma solüsyonuna nazikçe daldırın. Ardından tüpü -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın.
2. CRC Organoid Kültürü için PDX'lerin Hücre Süspansiyonuna Ekstraksiyonu
CRC PDX'lerin ayrışması için deneysel prosedürler Şekil 1B'de özetlenmiştir (adım 3).
- Yukarıda (adım 1.4.1) hazırlanmış tümör parçalarını 10 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin.
- Parçaları steril tıraş bıçağı kullanarak doğrayın ve 80 μL kollajenaz enzim stoğu ile 8 mL %10 fetal buzağı serumu (FCS)-Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM) içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın (bkz.
- Tüpü sıkıca kapatın ve sızıntıyı önlemek için kapağı parafilm ile sarın. Kıyılmış tümör parçalarını hücre süspansiyonuna ayırmak için, 37 ° C'de 2 saat boyunca hafifçe çalkalayın. Tüpte hala birçok sindirilmemiş doku parçası kalacağını unutmayın.
- Tüpü 300 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Hücre süspansiyonunu yapmak için 10 mL% 10 FCS-DMEM kullanarak hücre peletini çözün.
- Sindirilmemiş doku kalıntılarını ortadan kaldırmak için, 50 mL'lik konik bir tüp üzerine yerleştirilmiş 40 μm hücre süzgecini kullanarak hücre süspansiyonunu iki kez filtreleyin. Ardından, akışı 300 x g'da 5 °C'de 4 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti buz üzerinde tutun.
3. Yapay Hücre Dışı Matriks Üzerinde Kültürlenen CRC Organoidlerinin Üretilmesi
Kolon PDX'lerinin CRC organoid kültürü için deneysel prosedürler Şekil 1B'de özetlenmiştir (adım 4).
- Daha önce insan kolon organoidleri için tarif edilen ortamı kullanarak PDX'ten türetilmiş CRC organoidleri için uygun bir kültür ortamı oluşturun (Malzeme Tablosuna bakınız, "CRC organoid kültür ortamı").
- Buz üzerinde 12 oyuklu bir plaka üzerine oyuk başına 150 μL yapay hücre dışı matris (Malzeme Tablosuna bakınız) uygulayın ve daha sonra jelleri katılaştırmak için 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde 30-60 dakika inkübe edin.
- 3 x 105 hücre / mL'ye ayarlama elde etmek için hücre peletini CRC organoid kültür ortamı ile (adım 3.1'den itibaren) %5 FCS ile adım 2.5'ten askıya alın. Daha sonra, ortamın 1 mL'sini adım 3.2'de hazırlanan yapay hücre dışı matris kaplı plakaya tohumlayın. ve gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 altında inkübe edin. Hücre süspansiyonundaki tek hücreler ve çok hücreli kümeler (bir grup yapışık hücre) dahil olmak üzere tümör hücrelerinin sayısını saymak için bir hemositometre kullanın.
NOT: Bu çalışmada kollajenazın kalıntı enzimatik aktivitesini söndürmek için %5 FCS kullanılmıştır.
- Yapay hücre dışı matris kaplı plakadan ayrılan yüzen hücreler de dahil olmak üzere kültür ortamını ertesi gün 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne dikkatlice toplayın ve 5 dakika boyunca 1.400 x g'da santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve peleti buz üzerinde 70 μl yapay hücre dışı matris içinde yeniden süspanse edin.
- CRC hücresi canlılığını artırmak için, tümör hücresi içeren yapay hücre dışı matrisi, yapay hücre dışı matris kaplı plakaya bağlı tümör organoid hücrelerinin üzerine yerleştirin ve 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde 30 dakika inkübe edin, yapay hücre dışı matris kaplamasını katılaştırın. Daha sonra, 37 ° C'de% 5 CO 2 altında% 1 FCS ile% 1 CRC organoid hücre kültürü ortamı ile inkübe edin.
- Kültür ortamını her iki günde bir değiştirin. CRC organoidleri ortamı doldurduğundan, ortamı günlük olarak değiştirmek gerekebilir.
4. GFP Lentiviral Partiküllerinin Üretilmesi ve Zenginleştirilmesi
GFP lentiviral partiküllerinin üretilmesi ve zenginleştirilmesi için deneysel prosedürler Şekil 1C'de özetlenmiştir (adım 5).
- Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 besiyeri ile %10 FCS içeren hücreleri HEK293T ve aşağıdaki transfeksiyon prosedürü için altı adet 10 cm'lik tabak (tabak başına 2 x 10,6 hücre) hazırlayın.
- Tabak başına transfeksiyon için, bir PRRL-GFP vektörü (5 μg)12 ve pCMV-VSV-G (1 μg) ve pCMV-dR8.2 dvpr (5 μg) gibi iki lentiviral paketleme plazmidi ile DMEM'de 20 μl transfeksiyon reaktifi dahil olmak üzere 500 μL karışım hazırlayın, steril bir 1.5 mL mikrotüpte. Karışımı oda sıcaklığında 20 dakika tutun ve ardından 10 cm'lik tabakların her birinin üzerine koyun ve 18 saat inkübe edin.
- Orta maddeyi çıkarın, her yemeğe 5 mL taze %10 FCS-RPMI 1640 orta ekleyin ve 24 saat bekletin.
- Şartlandırılmış ortamı her tabaktan 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın ve toplam 30 mL ortamı gece boyunca 4 °C'de saklayın. Her tabağa 5 ml taze RPMI 1640 ekleyin ve 24 saat bekletin.
- Şartlandırılmış ortamı her tabaktan 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın ve toplamda 30 mL ortamın 30 mL'sini buz üzerinde tutun. Ardından, hücreleri atın.
- Hücreleri çıkarmak için ortamın 60 mL'sini (4.4-4.5 adımlarından itibaren) 0.45 μm'lik bir filtreden süzün ve bu miktarı ultrasantrifüjleme için on iki 5 mL polipropilen santrifüj tüpüne bölün.
- Virüsleri konsantre etmek için, 4 °C'de 1,5 saat boyunca 85.327 x g'da sallanan bir kova rotoru (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak santrifüjleyin.
- Ortamı hemen çıkarın. Konsantre virüs peletini çözmek için, on iki tüpün her birine 250 μL Besin Jambon Karışımı F-12 (F12)/DMEM ortamını FCS içermez ve gece boyunca 4 °C'de tutun. Virüs peletinin genellikle görünmez olduğunu unutmayın.
- Toplamda, muhtemelen mL başına 108 dönüştürücü birim (TU/mL) içeren GFP lentiviral partikülleri de dahil olmak üzere, konsantre 5x GFP lentivirüs stoğunun 3 mL'sini toplamak için ortamı nazikçe pipetleyin. Ardından, on iki adet 1,5 mL mikrotüpü (tüp başına 250 μL dahil) steril koşullar altında -80 °C'de bir yıla kadar saklayın. Birden fazla donma-çözülme döngüsünden kaçınmak için orijinal çözeltinin birçok küçük alikotunu hazırlayın.
>5. Yapay Hücre Dışı Matriks Üzerinde Kültürlenmiş GFP Lentiviral Partikülleri ile CRC Organoid Hücrelerinin Etiketlenmesi
CRC organoid hücrelerini GFP lentivirus ile etiketlemek için deneysel prosedürler Şekil 1C'de özetlenmiştir (adım 6).
- Adım 3.6'da hazırlanan CRC organoidlerinin 7-10 gün boyunca parazitsiz büyümesine izin verin, bunları steril bir hücre kazıyıcı kullanarak mekanik olarak hasat edin ve ardından 1.5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın.
not: Kültürde CRC organoidlerinin büyümesi, hastalardan alınan orijinal tümörlerin doğasına bağlıdır. CRC organoidlerinin aşırı büyümesini, 1: 2 bölünmüş bir oranda yeni bir yapay hücre dışı matris kaplı 12 oyuklu plakaya aktarmadan önce% 60-70 birleşme noktasında tutarak önleyin.
- Mikrotüpü 1.400 x g'da 3 dakika santrifüjleyin, kültür ortamını çıkarın ve hücre peletini hafifçe vurarak 500 μL PBS'de çözün.
- Mikrotüpü 1.400 x g'da 3 dakika santrifüjleyin ve PBS'yi ortadan kaldırın.
- Yapışan CRC organoidlerini ayırmak için, tüpteki hücre peletine 500 μL'lik bir proteolitik ve kollajenolitik enzim hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve hafifçe vurarak karıştırın. Daha sonra tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika dinlenmeye bırakın.
- Hücreleri kabaca ayırmak için hücre süspansiyonunu 1,5 mL'lik bir mikrotüpte birkaç kez 500 μL ek %1 FCS-DMEM ile çok nazikçe pipetleyin. Sert pipetleme ile CRC organoidlerinden tek hücrelerin oluşturulması, hücre canlılığını önemli ölçüde azaltır. Bu nedenle, 1,5 mL'lik bir mikrotüpte nazikçe pipetleyerek hücre kütlesinin hücre süspansiyonunda görsel olarak tespit edilebilir durumda bırakılması önemlidir.
- Hücre süspansiyonunu 1.400 x g'da 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
- Hücre peletini, 1.5 mL'lik bir mikrotüpte 100 μL 5x GFP lentivirüs stoğu (>108 TU/mL) ve 400 μl CRC organoid kültür ortamının bir karışımı ile 5 μl'de 5 x 105 ayrışmış tümör hücresi konsantrasyonuna ayarlamak için hafifçe vurarak çözün. 500 μl'de 5 ayrışmış tümör hücresi. Tümör hücrelerinin sayısını saymak için bir hemositometre kullanın, yukarıda açıklandığı gibi hücre süspansiyonundaki tek hücreler ve hücre grupları dahil olmak üzere (adım 3.3).
- Adım 3.2'de açıklandığı gibi yapay hücre dışı matris kaplı 12 oyuklu bir plaka hazırlayın. Daha sonra, adım 5.7'de hazırlanan hücre süspansiyonunun 500 μl'sini plakaya yerleştirin ve %5 CO2 altında 37 ° C'de 18 saat bekletin.
- Yapay hücre dışı matris kaplı plakadan ayrılan yüzen hücrelerin bulunduğu ortamı 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın. 1.400 x g'da santrifüjleyin ve ardından süpernatanı çıkarın ve peleti buz üzerinde 70 μl yapay hücre dışı matris içinde yeniden süspanse edin.
- CRC hücresi canlılığını arttırmak için, tümör hücresi içeren yapay hücre dışı matrisi, adım 3.5'te açıklandığı gibi yapay hücre dışı matris kaplı 12 oyuklu plakaya bağlı tümör organoidleri üzerine yerleştirin. Daha sonra, yapay hücre dışı matris kaplamayı katılaştırmak için plakayı 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörde 30 dakika inkübe edin ve daha sonra% 5 CO2 altında 37 ° C'de% 1 FCS ile 1 mL CRC organoid kültür ortamı ile kültürleyin.
- Enfeksiyondan 3 gün sonra hücreleri floresan mikroskobu altında gözlemleyin ve yüksek titre lentiviral partiküllerin kullanılması nedeniyle neredeyse %100 GFP pozitifliğini doğrulayın (bkz. Şekil 2A).
- Alıcı farelere enjeksiyondan önce hücre büyümesini genişletmek için CRC organoidlerini 7-10 gün boyunca kültürleyin.
>6. Alıcı Farelerde GFP Etiketli CRC Organoidleri Tarafından Metastaz Oluşumu
GFP etiketli CRC organoidleri kullanılarak metastaz üretimi için deneysel prosedürler Şekil 1C'de özetlenmiştir (adım 7).
- GFP etiketli CRC organoidlerini hücre süspansiyonuna ayırmak için, bunları steril bir hücre sıyırıcı kullanarak mekanik olarak hasat edin ve yukarıda açıklandığı gibi 1.5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın (adım 5.1).
- Mikrotüpü 1.400 x g'da 3 dakika santrifüjleyin, kültür ortamını çıkarın ve hücre peletini hafifçe vurarak 500 μL PBS'de çözün.
- Mikrotüpü 1.400 x g'da 3 dakika santrifüjleyin ve PBS'yi ortadan kaldırın.
- 500 μL hücre ayırma solüsyonunu tüpteki hücre peletinin üzerine yerleştirin ve hafifçe vurarak karıştırın. Ardından, yukarıda açıklandığı gibi yapışan CRC organoidlerini enzimatik olarak ayırmak için karışımı oda sıcaklığında 10 dakika bekletin (adım 5.4).
- Yukarıda açıklandığı gibi hücreleri kabaca ayırmak için hücre süspansiyonunu 1.5 mL'lik bir mikrotüpte birkaç kez 500 μL ek %1 FCS-DMEM ile çok nazikçe pipetleyin (adım 5.5). Sert pipetleme ile CRC organoidlerinden tek hücrelerin oluşturulması, hücre canlılığını önemli ölçüde azaltır. Bu nedenle, 1.5 mL'lik bir mikrotüpte hafifçe pipetleyerek hücre süspansiyonunda hücre kütlesini görsel olarak tespit edilebilir bırakın.
- Hücre süspansiyonunu 1.400 x g'da 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
- CRC PDX'lerin spontan metastaz fare modelini oluşturmak için:
- Fare başına% 50 yapay hücre dışı matris ile 50 μL PBS'de 5 x 105 hücre içeren bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Kullanmadan önce süspansiyonu buz üzerinde tutun. Adım 3.3'te belirtildiği gibi kanser hücrelerini saymak için bir hemositometre kullanın.
- Küçük hayvan inhalasyon anestezi cihazını kullanarak izofluran inhalasyonu olan bir fareyi uyuşturun ve cildi% 70 etanol ile dezenfekte edin. Uygun anestezitizasyon için normal solunum hızı ve derinliğinden ve ayak parmağını sıkıştırma refleksinin olmadığından emin olun. Gözlere veteriner merhemi, anestezi altındayken oküler kuruluğu önlemek için bir seçenektir.
- NOG fareyi laboratuvar tezgahına sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Rektal mukozayı steril cımbızla kavrayın ve yavaşça anüsten dışarı çekin. Ardından, adım 6.7.1'de hazırlanan hücre süspansiyonunu hemen bir şırınga kullanarak farenin rektal submukozasına enjekte edin (iğne boyutu: 22 G). Rutin olarak, sonuçları değerlendirmek için grup başına 4-6 fare kullanılır.
