Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
>1. Alıcı Farelerde GFP Etiketli CRC Organoidleri Tarafından Metastaz Oluşumu
- CRC PDX'lerin deneysel bir metastaz modelini oluşturmak için:
- Fare başına 50 μL PBS'de 4 x 104 hücre içeren bir CRC organoid hücre süspansiyonu hazırlayın. Kullanmadan önce süspansiyonu buz üzerinde tutun. Kanser hücrelerini saymak için bir hemositometre kullanın. (Hücre süspansiyonundaki tek hücreler ve çok hücreli kümeler dahil olmak üzere tümör hücrelerinin sayısını sayın).
- Küçük hayvan inhalasyon anestezi cihazını kullanarak izofluran inhalasyonu olan bir fareyi uyuşturun ve cildi% 70 etanol ile dezenfekte edin. Uygun anestezitizasyon için normal solunum hızı ve derinliğinden ve ayak parmağını sıkıştırma refleksinin olmadığından emin olun. Anestezi altındayken oküler kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhemi koymak bir seçenektir.
- Anestezi uygulanmış NOG fareyi laboratuvar tezgahına yüzüstü pozisyonda yerleştirin. Sol kanadın alt kısmında küçük bir kesi yapın ve ardından steril makas ve cımbız kullanarak dalağı dikkatlice ortaya çıkarmak için peritonu kesin. Dalağa bağlı yağ dokusunu steril cımbızla kavrayın, ardından 50 μL hücre süspansiyonunu (yukarıdaki gibi hazırlanır, adım 1.1) dalağa yavaşça enjekte edin. Hücre süspansiyonunun dalaktan dışa doğru sızıntı olmadan uygun şekilde enjekte edildiğinden emin olun. Rutin olarak, sonuçları değerlendirmek için grup başına 4 fare kullanılır.
- Ameliyattan sonra tüm fareleri ılık bir ped üzerine yerleştirin ve yeterli bilinç geri gelene kadar sternal yaslanmış pozisyonda tutun. Fareler tamamen iyileştikten ve dört ayak üzerinde de oturabilenler , onları ev kafeslerine geri koyun. Avlanmayı önlemek için, aynı kafeste ameliyat edilmeyen hayvanlarla üremeye izin vermeyin.
- Sütür sızıntısı olup olmadığını kontrol edin ve ertesi gün farelerin cerrahi olarak tedavi edilen grupta canlı olduğunu onaylayın. Fareleri hastalık belirtileri açısından kontrol edin ve haftada bir kez tüm farelerde kaliper kullanarak tümör boyutlarını ölçün.
- Enjeksiyondan sonra spontan metastazı (2,5 aya kadar olan süreler boyunca) ve deneysel metastazı (1 ay) tespit etmek için fareleri gözlemleyin.
- Fareleri belirtilen günlerde anestezi ve servikal çıkık ile sakrifiye edin. Primer tümörleri ve karaciğer ve akciğerler dahil olmak üzere çeşitli dokuları inceleyin. Diseke edilmiş tümörleri ve organları 10 cm'lik bir Petri kabına 5 mL buz gibi PBS'ye yerleştirin ve buz üzerinde saklayın.
- GFP pozitif CRC organoid hücrelerini tespit etmek için, diseke edilen dokuları stereo-floresan mikroskobu altında gözlemleyin. CCD kamera ile görüntü elde edin ve standart görüntü işleme yazılımını kullanarak hazırlayın
