Segmental Adeno-Cre Enfeksiyonu: Genetik Olarak Tasarlanmış Fare Modelleri Kullanılarak İzole Kolorektal Kanser Oluşturma Tekniği

Özet

Kaynak: Betzler, A. M., et al. Sporadik Kolorektal Kanserin Genetik Olarak Tasarlanmış Bir Fare Modeli.J. Vis. Uzm. (2017).

Bu videoda, segmental adeno-cre enfeksiyonu ile kolorektal fare modelinin oluşturulması anlatılmaktadır. Enfekte kolon segmenti, mukozanın bu segmentinde tümörigeneze yol açar ve sonuçta adenomların invaziv ve metastatik karsinoma ilerlemesine neden olur. Bu model, kanser biyolojisi çalışmaları ve klinik öncesi terapötik çalışmalar için çekici bir platformdur.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Cerrahi Adeno-kr Enfeksiyonu Yoluyla Lokal Tümör İndüksiyonu

1. Hayvanların ameliyata hazırlanması
   not: Hemen hemen herhangi bir koşullu ("floxlu") mutasyon, burada açıklanan yöntemle indüklenebilir. Apc, Kras veya Tp53 gibi kolorektal kanserle ilgili genlerdeki mutasyonların kullanılması önerilir. Cre rekombinasyonunun verimliliği, eksize edilecek yapının boyutuna bağlıdır. Büyük floklu diziler daha az verimli bir şekilde eksize edilir. Tüm alellerin rekombinasyonu tümörlerde PCR ile doğrulanmalıdır.
   1. Kolorektal tümörlerin gelişimi için, temel bir CRC modeli için aşağıdaki koşullu alellerin bir çaprazını kullanın (parantez içindeki MGI veritabanı numarası):
      Apc^tm2Rak (MGI: 3688435)
      Kras^tm4Tyj (MGI: 2429948)
      Tp53^tm2Tyj (MGI: 3039263)
   2. Bir floresan raportör aleli gerekiyorsa (ör., mikrometastazı tespit etmek için), aşağıdaki aleli kullanın:
      Gt(ROSA)26Sor^{tm6(CAG-ZsGreen1)Hze} (MGI: 3809522)
      not: Yukarıdaki tüm suşlar, NCI Fare Deposu veya Jackson Laboratuvarı aracılığıyla edinilebilir. Adenoviral enfeksiyondan önce kalan tüm dışkı maddeleri dışarı atılabildiğinden oruç tutmaya gerek yoktur. Preoperatif açlık, daha yüksek perioperatif mortaliteye yol açar ve küçük kemirgenler için muazzam bir stres oluşturur.
   3. Genel anestezi için hacimce 3 - 3.5 oranında sevofluran kullanın. Ayak parmağını kıstırma refleksinin kaybı yeterli anesteziyi gösterir.
   4. İlk insizyondan önce deri altına 0.05 mg / kg buprenorfin enjekte edin.
   5. Korneanın kurumasını önlemek için anestezi uygulanmış farenin gözlerini oftalmik merhem ile örtün.
   6. Fareyi küçük bir masanın üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Fareyi dizginlemek için travmatik olmayan yapışkan bantlar kullanın.
   7. Karnınızı elektrikli tıraş makinesiyle tıraş edin (tüy dökücü krem alternatif olarak kullanılabilir) ve alkollü bezler veya iyot ile dezenfekte edin. Üretici tarafından önerilen temas süresini kullanın.
   8. Cerrahi alanı steril örtülerle örtün.
      not: Perioperatif antibiyotiklerin kullanımı isteğe bağlıdır ve kurumsal yönergelere tabidir.
   9. Tüm cerrahi prosedürler için steril, tek kullanımlık veya sterilize edilmiş aletler kullanın.
2. Orta hat laparotomisi ve kolonun açığa çıkması
   1. Alt karın derisinde orta hat kesisi (~ 15 mm) yapmak için makas kullanın (alternatif olarak neşter kullanılabilir).
   2. Karın duvarı kaslarını forseps ile alın ve karın boşluğunu açarak makasla dikkatlice kesin.
   3. Distal kolonu tanımlayın, sadece atravmatik forseps ile dokunun. Kolonu anüsün yaklaşık 15 mm proksimalinde hassas bir kelepçe (örneğin, bir Mikro Serrefine vasküler klemp) ile kelepçeleyin.
      not: Kolonun savunmasızlığına her zaman özellikle dikkat edin. Perforasyon kaçınılmaz olarak peritonit ve sepsise yol açar ve hayvanın ötenazisini gerektirir.
3. Adeno-cre virüsü ile segmental kolon enfeksiyonu
   1. Esnek bir Teflon tüpü transanal olarak yerleştirin ve daha önce anal kenardan 15 mm uzağa yerleştirilen kelepçe tarafından elde edilen lümen tıkanıklığına ulaşana kadar dikkatlice ilerletin. Delinmeye neden olabileceğinden aşırı güç kullanmayın.
   2. Tüpü 30 G'lik bir kanül ile kanüle edin, standart 1 mL'lik bir şırınga bağlayın ve kalan dışkı maddesini boşaltmak için kolonu normal salinle yıkayın. Bu, birkaç mL salin gerektirebilir.
   3. Distal kolon boşaldığında, tüpü çıkarın ve yeni bir Teflon tüp ile değiştirin ve yukarıda açıklandığı gibi doğrudan kelepçenin distaline yerleştirin.
   4. Proksimal klempin ~ 3 mm distalinde ikinci bir klemple kolonu tıkayın (yani, yerleştirilen tüpün üzerinde, anal kenardan ~ 12 mm), 3 mm'lik izole bir segmentin enfekte olmasına neden olun.
      not: Segmentin distal oklüzyonu için, Fogarty koroner arter klipslerinin, klempin dalları arasındaki intraluminal tüpe rağmen kolonun sıkı tıkanmasına yol açan, lastikli oldukları için en uygun olduğu kanıtlanmıştır.
   5. 50 - 80 μL% 0.25 Tripsin-EDTA'yı klemplenmiş kolon segmentine dikkatlice enjekte etmek için ikinci bir şırınga (30G kanül ile standart 1 mL) kullanın ve 10 dakika inkübe edin. Sıvının geri sızmasını önlemek için kanülü ve şırıngayı Teflon tüpe bağlı bırakın.
      not: Mukozal bariyeri kırmak ve kript kök hücrelerine ulaşmak için kolon şişirilmelidir, ancak klemplenmiş segmentin delinmesini önlemek için çok şişirilmemelidir.
   6. Önce distal kelepçeyi ve ardından tripsin tüpünü çıkarın.
   7. Kalan tripsini çıkarmak için distal kolonu ~ 500 μL normal salin ile yıkayın.
   8. Yeni bir Teflon tüp yerleştirin, distal kelepçeyi tekrar yerine yerleştirin ve kolon segmentini 50 - 80 μL adenoviral çözelti (fosfat tamponlu salin içinde 10¹¹ plak oluşturan birim (PFU) / mL) ile şişirin ve 30 dakika inkübe edin (Şekil 2A).
      not: Adeno-cre ile temas, şartlı olarak mutant farelerin herhangi bir dokusunda tümör gelişimine yol açabileceğinden viral çözeltiyi dökmeyin.
   9. Kelepçeleri ve tüpü çıkarın.
4. Karnın kapatılması ve ameliyat sonrası iyileşme
   1. Karın duvarını 6-0 hızla emilebilir koşu sütürleriyle kapatın (ör., polidioksanon (PDS)).
   2. Cildi cerrahi yara klipsleri ile kapatın.
   3. Fareyi anesteziden tamamen çıkana kadar 38 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığına yerleştirin.
   4. Ameliyattan 12 saat sonra 0.05 mg / kg buprenorfin i.p.'lik başka bir bolus uygulayın, ardından gerekirse her 12 saatte bir ek buprenorfin bolusları uygulayın.
   5. Tümör büyümesine bağlı sıkıntı belirtileri için fareleri günde en az bir kez izleyin.

2. Kolonoskopi

NOT: Kullanılan koşullu mutasyonlara bağlı olarak, adenoviral enfeksiyon 2-4 hafta içinde endoskopik olarak görünür tümörlere yol açar. Bu nedenle, adenoviral indüksiyondan 2 hafta sonra ameliyat sonrası ilk kolonoskopiyi yapın ve her 2 haftada bir tekrarlayın. Murin kolonoskopisi için ticari olarak temin edilebilen bir sistem önerilir.

1. Kolonoskopi için hayvanların hazırlanması
   not: Oruç tutmak gerekli değildir. Kalan dışkı maddesi genellikle distal kolonda iyi şekillendirilmiştir ve kolonoskopi sırasında tümörün dışına itilebilir, bu da stresli tekrarlanan oruç tutma sürecini gereksiz kılar.
   1. Genel anestezi için hacimce 3 - 3.5 oranında sevofluran kullanın. Ayak parmağını kıstırma refleksinin kaybı yeterli anesteziyi gösterir.
   2. Korneanın kurumasını önlemek için anestezi uygulanmış farelerin gözlerini oftalmik merhem ile örtün.
   3. Fareleri küçük bir masa üzerinde sırtüstü pozisyonda tutun.
2. Kolonoskopi
   1. Dürbünü (çap 1.9 mm; uzunluk 10 cm) anüs yoluyla bağırsak sistemine yerleştirin ve kolonu şişirmek için görsel kontrol altında havayı dikkatlice şişirin. Muayene için gerekenden daha fazla hava şişirmeyin.
      not: Hava insüflasyonu için kolonoskopi sisteminin buğu önleyici hava pompası kullanılabilir. Buğu önleyici hava pompası yoksa, çok düşük basınç ayarlarına sahip başka bir hava pompası kullanılabilir veya hassas bir basınç düşürme valfine sahip basınçlı hava kullanılabilir. Karbondioksit (CO₂) küçük kemirgenlerde kolayca asidoza yol açar ve bu nedenle kaçınılmalıdır.
   2. Distal kolonda bir mukozal lezyon tanımlanana kadar kapsamı dikkatlice ileri doğru itin (Şekil 1A - 1D).
   3. Endoskopik görüntüleri daha sonra değerlendirmek üzere kaydedin. İntraluminal tümörler için endoskopik skorlama sistemi daha önce tanımlanmıştır.
   4. Dürbünü dikkatlice çıkarın ve fareyi anesteziden tamamen çıkana kadar 38 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirin.

Sonuçlar

Şekil 1. Kolorektal tümörlerin kolonoskopik görüntüleri (parantez içinde verilen hayvanın koşullu alelleri).
A. Normal distal kolon. B. Adeno-cre enfeksiyonundan 2 hafta sonra erken adenom. Bu faredeki bir GFP muhabir alelinden kaynaklanan yeşil renge dikkat edin. (Apc^tm2Rak, Kras^tm4Tyj, Gt(ROSA)26Sor^{tm6(CAG-ZsGreen1)Hze}

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu	Yaşam Teknolojileri GmbH	14190169
Tripsin-EDTA (% 0.25, FenolRed)	Yaşam Teknolojileri GmbH	25200072
Normal tuzlu su% 0.9 (E154)	Serumwerk Bernburg AG	10013
Aqua reklam enjektabilia	B. Braun Melsungen AG	235144
Ad5CMV-Cre (adenovirüs, c = 2E +11 PFU/mL)	Gen Transfer Vektör Çekirdeği Iowa Üniversitesi
15 mL, 50 mL santrifüj tüpleri	Greiner Bio-One GmbH	188271/227270
Eppendorf tüpleri 1,5 mL/ 2 mL	Sarstedt AG & Co.	72.695.400
Petri kabı PS 100/15 mm (steril, Nuclon)	Fisher Bilimsel GmbH	10508921/ NUNC150350
1 mL Şırınga (ölü hacim olmadan) - Injekt-F SOLO	Braun/neoLab	194291661
30G enjeksiyon iğnesi	BECTON DICKINSON	304000
Sevofluran (Sevoflurane AbbVie)	AbbVie Germany GmbH & Co. KG
Tıbbi oksijen	Air Liquide Medical GmbH
Buprenorfin (Temjezik)	Bireysel Eu Ltd.
Bepanthen - oftalmik merhem	Bayer Hayati GmbH	10047757
Masa Üstü Araştırma Anestezi Makinesi x / O2 Flush w / Sevofluran Buharlaştırıcı	Park Alanı Bilimsel	V3000PS/PK
Selüloz çubuklar	Lohmann & Rauscher Almanya	13356
İnsülin şırınga EMG 1 mL (30G kanül ile)	B. Braun Melsungen AG	9161627S
İnce Delikli Boru (delik: 0,28 mm / çap: 0,61 mm)	Smiths Medical Deutschland 8	800/100/100
Mikro Adson Forseps	Güzel Bilim Araçları	11018-12
İris Makas - ToughCut	Güzel Bilim Araçları	14058-11
Olsen-Hegar İğne Tutucu	Güzel Bilim Araçları	12002-12
AutoClip Kiti	Güzel Bilim Araçları	12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (cerrahi sütür)	Johnson & Johnson Medical GmbH	Z1012H
Kavisli Mikro Serrefine Vasküler Kelepçe	Güzel Bilim Araçları	18055-05
Fogarty Bahar Klipsleri	Ertuğrul	CDSAFE 6 (İngilizce)
Sıcak Tabak 062	Labotect (Labotect	13854
Isis - Saç tıraş makinesi	Aesculap - Braun
Soğuk Işık Fıskiyesi XENON 175	Karl Storz ·	20132101-1	Karl Storz Coloview Sistemi Mainz
Fiber Optik Işık Kablosu	Karl Storz ·	69495NL	Karl Storz Coloview Sistemi Mainz
TRICAM Üç Çipli Kamera Kafası	Karl Storz ·	20221030	Karl Storz Coloview Sistemi Mainz
TRICAM SLII Kamera Kontrol Ünitesi	Karl Storz ·	20223011-1	Karl Storz Coloview Sistemi Mainz
15" Düz Ekran Monitör EndoVue	Karl Storz ·	9415NN	Karl Storz Coloview Sistemi Mainz
HOPKINS Düz İleri Teleskop çap 1.9 mm; uzunluk 10 cm otoklavlanabilir fiber optik ışık iletimi dahil	Karl Storz ·	64301AA
Koruma ve Muayene Kılıfı	Karl Storz ·	61029C

)