1. Mikrotübül bağlama Testi
- Mikrotübül bağlama testi için,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş Minimum Esansiyel Besiyeri (MEM) içeren 100 mm doku kültürü kaplarına ~ 1 x10 6 HCT 116 hücresi ekleyin. Bir günlük kültürlemeden sonra, hücreler% 60-70 birleşmeye ulaşacaktır.
- 20 μM (40 μL) paklitaksel ve 1 mM (20 μL) GTP ekleyerek 4 °C'de saklanan 10X PEM tamponundan 1X (20 mL) PEM tamponu hazırlayın. Mikrotübül (MT) stoğunu -80 °C dondurucudan ve E. coli tau çalışma stoğunu -20 °C dondurucudan alın.
- Numuneleri Tablo 1'e göre hazırlayın.
- 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Ultrasantrifüj 25 ° C'de 60 dakika boyunca 100.000 x g'da inkübe edin.
- Bağlanmamış tau içeren 120 μL süpernatanı temiz ve etiketli tüplere aktarın.
- Bağlı tau içeren pelete 120 μL (süpernatan ile aynı hacimde) 5X numune tamponu ekleyin ve iyice karıştırın. Solüsyonu etiketli tüpleri temizlemek için aktarın ve iyice karıştırın.
- Ticari protein tahlil kitlerini kullanarak Bradford tahlili ile protein konsantrasyonunu ölçün.
not: Numuneleri hazırlarken, hem pelet hem de süpernatan numuneleri hazırlamak için çözelti hacmini (adım 1.6) kullanın.
- Eşdeğer protein konsantrasyonunda numuneler hazırlayın ve DTT (400 mM) içeren taze hazırlanmış 4x SDS jel yükleme tamponu ekleyin.
not: Numuneler bu aşamada -20 °C'de saklanabilir.
- Numuneleri 100 °C'de bir ısı bloğunda 5 dakika inkübe edin. Numuneleri bir girdap kullanarak karıştırın. Oda sıcaklığında ~ 10-15 dakika soğutun.
- SDS-PAGE ile %10'luk bir poliakrilamid jeli çalıştırmak için bir elektroforez sistemi kurun.
- % 10'luk bir poliakrilamid jel üzerine oyuk başına 10 μg protein (13 μL numune) yükleyin. Moleküler ağırlıklı merdiveni yükleyin.
- Numuneyi yükledikten sonra, sabit bir voltaj sağlamak için elektroforez sisteminin pozitif ve negatif elektrotlarını bir güç kaynağına bağlayın. Başlangıçta, protein örneklerini istifleme jelinden çözme jeline taşımak için 20 dakika boyunca 70 V'ta başlayın. Ardından, voltajı 125 V'a yükseltin ve numuneler ve protein merdiveni jelin sonuna ulaşana kadar jeli yaklaşık 70-120 dakika çalıştırın.
- Elektroforezin tamamlanmasından sonra, jeli ıslak bir elektroblotlama sistemi kullanarak bir PVDF membranına aktarın. 100 V'ta ~ 100 dakika aktarın.
- Moleküler ağırlıklı merdivenin yan tarafında küçük bir kesik yaparak lekeyi işaretleyin. Lekeyi kesmek için şeffaf bir plastik tabaka ve keskin bir kesici kullanın.
- Membranı oda sıcaklığında 90 dakika boyunca% 4 BSA bloke edici tamponda bloke edin.
- Lekeyi gece boyunca 4 ° C'de primer-antikor çözeltisinde (1: 5.000'de anti-tau) inkübe edin. Lekeyi PBST'de her biri 7 dakika boyunca dört kez yıkayın.
- İlgili ikincil antikor çözeltisini hazırlayın (1: 5.000'de keçi anti-fare IgG) ve lekeyi oda sıcaklığında 90 dakika inkübe edin. PBST'de her biri 7 dakika boyunca dört kez yıkayın.
- Üreticinin tavsiyelerine göre bir kemilüminesans kiti kullanarak lekeyi geliştirin. Lekeyi şeffaf plastik sargı ile örtün. İlgili yazılımla kemilüminesans için bir kemilüminesans görüntüleme sistemi ile görüntüler elde edin.
Tablo 1: Mikrotübül bağlama deneyi için numune hazırlama.
| örnek | ad | Mikrotübül gerekli | İhtiyaç duyulan ana protein | PEM-GTP-PTX |
| 1 | HCT 116-Kontrol (6.21 μg/μl) | 2 μl | 9,66 μl (60 μg) | 108,34 μl |
| 2 | HCT 116-Kurkumin 10 μM (4.81 μg/μl) | 2 μl | 16.63 μl (80 μg) | 101,37 μl |
| 3 | HCT 116-Kurkumin 20 μM (3,28 μg/μl) | 2 μl | 30,49 μl (100 μg) | 87,51 μl |
| 4 | HCT 116-LiCl 25 mM (5,43 μg/μl) | 2 μl | 18,42 μL (100 μg) | 99,58 μl |
| 5 | E. coli tau | 2 μl | 1 μl tau-352 | 117 μl |
| 6 | Yalnızca MT | 2 μl | Devamı | 118 μl |
| | | | Her biri 120 μl |
