Tam Kan Örneğinden CTC İzolasyonu: Murin Kolorektal Kanser Modelinden CTC Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Kochall, S., et al. Kolorektal Kanserin Ortotopik Fare Modelinde Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin İzolasyonu. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu videoda, ötenazi uygulanmış bir kolorektal tümör fare modelinin tam kan örneğinden dolaşımdaki tümör hücrelerinin izole edilmesi için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Bu izole CTC'ler kültürlenebilir ve amaçlanan aşağı akış analizi için kullanılabilir.

Protokol

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Tam Kan Örneklerinden Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin İzolasyonu

NOT: Anestezi uygulanmış farelerde transkutanöz kardiyak ponksiyon ve ardından ötenazi ile kan elde edin. İdeal olarak, 1.000 μL kan, 100 μL bir antikoagülan (Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) veya heparin) ile önceden doldurulmuş bir şırıngaya çekilir. CTC'leri tanımlamak için bir anti-insan-EpCAM (epitel hücre adezyon molekülü) antikoru kullanın. Bu, fare modelinde insan epitel hücre dizileri kullanılıyorsa çok iyi çalışır. Diğer uygulamalar için farklı antikorlar gerekebilir.

1. CTC zenginleştirme:
   1. 15 mL'lik tüpleri 5 mL yoğunluk gradyan ortamı ile önceden doldurun ve kanı dikkatlice 15 mL'lik tüpe aktarın.
   2. Santrifüjleyin (frensiz 300 x g'da 30 dakika) ve üst süpernatanı dikkatlice çıkarın.
   3. Gerisini 15 mL'lik yeni bir tüpe dökün ve santrifüjleyin (15 dakika, frenli 300 x g).
   4. Mononükleer hücreleri içeren interfazı geri kazanın (geri kalanını atın) ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.
   5. Peleti 200 μL PBS /% 1 EDTA içinde yeniden süspanse edin ve 4 μL EpCAM antikoru ekleyin. Karanlıkta buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.
2. Tarama ve toplama
   1. Aşağıdaki tamponu hazırlayın (aşağıda toplama tamponu olarak anılacaktır): PBS +% 10 fetal buzağı serumu (FCS) +% 1 Penisilin / Streptomisin (% 1) +% 0.8 EDTA.
   2. 6 cm'lik steril bir Petri kabına ~1 cm'lik bir daire çizmek için bir PAP kalemi kullanın (sıvının tabak içinde dağılmasını önler) ve bu daireye 700 μL toplama tamponu pipetleyin.
   3. Daire içindeki 700 μL'lik toplama tamponuna 50 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Mikroskopla hücrelerin yoğunluğunu kontrol edin. Çok yoğunsa numuneyi farklı tabaklara bölün.
   4. Hücrelerin yerleşmesini bekleyin (~ 5 dk).
   5. Lekeli (= EpCAM pozitif) hücreler için hücre süspansiyonu damlasını tarayın.
   6. Bir hücre bulunduğunda, hücreyi mikromanipülatör ile seçin ve amaçlanan aşağı akış analizine (örneğin, RNA ekstraksiyon tamponu veya kültür ortamı) bağlı olarak 50 μL'lik bir tampona koyun.
   7. Amaçlanan aşağı akış analizlerine bağlı olarak, EpCAM negatif hücreleri ve / veya ortamı negatif kontroller olarak izole edin.
   8. Aşağı akış analizlerine devam edin (örneğin, hücre kültürü, PCR).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Yoğunluk gradyan ortamı – Ficoll	Kök Hücre - Lenforep	7801
Alexa Fluor 488 anti-insan CD326 (EpCAM) Antikor klonu 9C4	Biyo Efsane	324210
Alexa Fluor 488 anti-fare CD326 (EpCAM) Antikor klonu G8.8	Biyo Efsane	118210
Petri Kabı, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Havalandırma	Greiner biyo-bir	628102
Floresan Hücre Kültürü Mikroskobu	Leica Belediyesi
Transferman 4r Mikromanipülatör	Eppendorf Belediyesi
CellTram Hava	Eppendorf Belediyesi		Mikromanipülatöre bağlı aspirasyon pompası
Dmz Üniversal Mikroelektrot Çektirme	Dagan Şirketi		Tek hücreli aspirasyon için mikro kılcal damarların üretimi için gereklidir
Prizma Cam Kılcal Damarlar	Dagan Şirketi
PAP kalemi	Abcam Belediyesi
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu	Yaşam Teknolojileri GmbH	14190169	toplama tamponu
Fetal Baldır Serumu (FCS)	BIOCHROM AG	S 0115	toplama tamponu
Penisilin/Streptomisin (PenStrep)	Yaşam Teknolojileri GmbH	15140122	toplama tamponu
Edta	Roth	8040.1	toplama tamponu
İmmünohistokimya
Saflaştırılmış anti-insan CD326 (EpCAM) antikor klonu 9C4	Biyo Efsane	324201	EpCAM immünohistokimyası
HRP tavşan anti-fare IgG	Abcam Belediyesi	ab97046	EpCAM immünohistokimyası