$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Organotipik Hazırlık:
Fibroblast emdirilmiş organotipik jelin hazırlanması:
- % 10 FCS ve 292 μg / ml L-Glutamin ile desteklenmiş DMEM'de organotipik başına 5 x 105 hücre içeren bir fibroblast hücre süspansiyonu hazırlayın.
- Organotipik jelleri buz üzerinde aşağıdaki oranlarda oluşturun:
- • 7 hacim Sıçan Kuyruğu Kolajeni: Matrigel karışımı (1:1)
- • 1 hacim filtrelenmiş 10x DMEM
- • 1 hacim FCS
- • 5 x 105 fibroblast
içeren 1 hacim fibroblast hücre süspansiyonu
9 jel için (jel başına 1 ml), 10 ml hazırlayın ve kabarcıkları önlemek için hafifçe karıştırın.
- 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 ml ekleyin ve jellerin sertleşmesini sağlamak için nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de 1 saat inkübe edin. 1 saat sonra, jellerin üzerine 1 ml DMEM (% 10 FCS) / Glut ekleyin ve gece boyunca inkübatöre geri dönün.
- Ertesi gün, jellerin üstünden besiyerini aspire edin ve 5 x 105 CRC epitel hücresi içeren 1 ml besiyerini plakalandırın.
Jel kaplı naylon levhaların hazırlanması:
- 1,5 cm x 1,5 cm ölçülerinde steril, otoklavlanmış naylon çarşafları önceden hazırlayın.
- Steril forseps kullanarak, gerekli sayıda naylon tabakayı 10 cm'lik bir kültür kabına yerleştirin (genellikle tabak başına 4 naylon tabaka yerleştirilebilir).
- Aşağıdaki sırayla buz üzerinde jel hazırlayın (naylon tabaka başına toplam 250 μl hacim gereklidir):
- • 7 hacim Sıçan Kuyruğu Kolajen
- • 1 hacim filtrelenmiş 10x DMEM
- • 1 hacim FCS
- • 1 hacim DMEM %10 FCS/Glut
- Çözelti sarı ise, çözelti pembeye dönene kadar 50 μl'lik alikotlara 0.1 M NaOH ekleyerek nötralize edin.
- Her bir naylon tabakaya bu çözeltiden 250 μl ekleyin ve jelin sertleşmesine izin vermek için% 5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- Makyaj PBS'de% 1 glutaraldehit çözeltisi. Jel sertleştikten sonra her 10 cm'lik kültür kabına 10 ml ekleyin ve 4 ° C'de 1 saat inkübe edin.
- Naylon tabakaları 3 kez PBS'de ve 1 kez DMEM (% 10 FCS) / Glu'da yıkayın ve gece boyunca DMEM / Glu'da 4 ° C'de inkübe edin.
Organotipik jellerin istila için çelik ızgaralara yükseltilmesi:
- Paslanmaz çelik sacları tripod şeklinde katlayarak iskele ızgaralarını önceden hazırlayın. Kullanmadan önce otoklavlayın.
- Altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna çelik bir ızgara yerleştirmek için etanolde sterilize edilmiş forseps kullanın.
- Her bir ızgaranın üzerine, kollajen tarafı en üstte olacak şekilde jel kaplı bir naylon tabaka yerleştirin.
- Organotipik jelleri, etanol içinde sterilize edilmiş bir spatula kullanarak 24 oyuklu plakadan yükseltilmiş naylon tabakaya dikkatlice aktarın.
- Kuyuyu, naylon tabaka ortamla temas edene kadar ancak suya batırılmayana kadar %10 FCS ile desteklenmiş DMEM %10 FCS/Glut ile doldurun. Ortamın organotipik jele temas etmediğinden emin olun.
- % 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de 14 gün boyunca inkübe edin ve ortamı 2 günde bir değiştirin.
2. Organotipik Fiksasyon
- Naylon levha da dahil olmak üzere tüm organotipik tabakayı kuyudan çıkarın ve streç film üzerine yerleştirin.
- Temiz, tek kullanımlık bir neşter kullanarak organotipik ve naylon levhayı ikiye bölün ve her iki yarıyı da oda sıcaklığında 24 saat formaldehit içinde sabitleyin.
- Formaldehiti 24 saat sonra %70 etanol ile değiştirin ve parafine gömmeden, kesit ayırmadan ve boyamadan önce gece boyunca bırakın.
3. İnvaziv Sınırın Lazer Mikrodiseksiyonu
- Membrana monte slaytlar üzerine 10 μm kalınlığa kadar kesit.
- 1 dakika boyunca Ksilen uygulayarak bölümleri deparafinize edin, ardından Ksileni çıkarın ve% 75 etanolü 1 dakika daha sabitleyin.
- Etanolü çıkarın ve 1 dakika boyunca %0.125 Cresyl Violet solüsyonu ile lekeleyin. Cresyl Violet, epitel hücrelerini vurgular ve stromadan kolay ayrım yapılmasına izin verir.
- Cresyl Violet'i çıkarın ve %100 etanol ile durulamadan önce 1 dakika daha %100 etanol uygulayın. Slaytların 30 dakika kurumasına izin verin.
- Seçilen platformu kullanarak lazer mikrodiseksiyonu yapın (örneğin, Leica AS sistemi).
- Mikrodiseke edilecek lekeli bölümü aşağı bakacak şekilde cam slaytı mikroskop tablasına yerleştirin.
- Toplama kasetine 0.5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpü monte edin ve mikrodiseke dokunun toplanacağı kapağa 50 μl hücre lizis tamponu (örneğin, DNA, RNA veya protein lizis tamponu) ekleyin.
- Doğrudan görüş altında, ilgilenilen dokuyu tanımlamak için joystick'i kullanın. Yazılım arayüzünü kullanarak, tümör istilası cephesinde mikrodiseke edilecek hücreleri vurgulayarak lekeli organik bölüme açıklama ekleyin.
- Lazere, hem vurgulanan bölümü kesmeli hem de mikrodiseke edilmiş dokuyu mikrosantrifüj tüpünün kapağına itmelidir.
- Yeterli malzeme toplandıktan sonra, toplama kasetini çıkarın, mikrosantrifüj tüpünü kapatın ve lizis tamponunu tüpün dibine çekmek için hafifçe döndürün.
- Mikrodiseksiyon tamamlanana kadar numuneleri buzun üzerine yerleştirin. İlgilenilen analiti çıkarmak için numuneleri uygun bir yöntemle işleyin.