Traksiyon Sitometrisi Testi: Kanser Hücrelerinin ECM Üzerine Uyguladığı Traksiyon Kuvvetini Ölçmek İçin Bir Yöntem

Abstract

Kaynak: Ali, M. Y., et al. Primer İnsan Kolon Tümörü Hücrelerinin Cerrahi Dokulardan İzole Edilmesi ve Traksiyon Sitometrisi için Doğrudan Yumuşak Elastik Substratlar Üzerinde Kültürlenmesi. J. Vis. Uzm. (2015).

Bu videoda çekiş kuvveti mikroskobu testi açıklanmaktadır. Tahlil, gömülü floresan boncuklara sahip yumuşak elastik hidrojel üzerinde bulunan hücre dışı matris üzerindeki insan kolon kanseri hücrelerinin hücresel çekişini belirler. Floresan boncukların ortaya çıkan yer değiştirmesi, uygun bir yazılım kullanılarak ölçülür.

Protocol

>1. Çekiş Kuvveti Mikroskobu Testi

1. Çekiş deneyleri başlamadan önce %0.25 tripsin-EDTA/%10 SDS solüsyonunu 37 °C'de bir su banyosunda 10 dakika ısıtın.
2. Floresan ters mikroskop aşamasında (32X büyütme) hücre kültürü inkübatöründen bir jeli (ECM molekülleri, insan fibronektinini ile 50 μg/ml konsantrasyonda işlevselleştirin) çıkarın.
3. Görüş alanında tek bir hücre bulun. Petri kabı kapağını çıkarın.
4. Hücrenin faz kontrastlı bir görüntüsünü alın (örneğin, Şekil 1).
5. Görüntüleme modunu floresan olarak değiştirin ve uygun filtreyi seçin. Bu süre zarfında mikroskop tablasını veya numuneyi hareket ettirmeyin.
6. Hücresel çekiş ile yer değiştiren floresan boncukların bir görüntüsünü alın (Şekil 2C).
7. Hücreyi jelden ayırmak için Petri kabına 1 ml tripsin / SDS çözeltisi ekleyin. Bu süre zarfında mikroskop tablasını veya numuneyi hareket ettirmeyin. Ayrıca, jelden tamamen çıkarılmasını sağlamak için hücrenin bir kontrol görüntüsünü alın.
8. Hücre çıkarıldıktan sonra boncukların referans (sıfır kuvvet) görüntüsünü alın.
9. Diğer tüm jeller için 1.2-1.8 adımlarını tekrarlayın.
10. Her durum için adım 1.6 ve 1.8'de elde edilen iki görüntüden ImageJ kullanarak bir görüntü yığını oluşturun. Görüntü yığınını oluşturmak için, görüntüleri açtıktan sonra ImageJ'de aşağıdaki komut dizisini kullanın: Görüntü → Yığınları → Yığınlanacak görüntüler.
11. Yer değiştirme alanını ve çekişi elde etmek için, yayınlanan yöntemleri izleyerek ImageJ eklentilerini kullanın. Aşağıdaki bağlantıyı kullanarak bu eklentiler için kodları ve ayrıntılı öğreticileri edinin: https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
    1. 'Şablon Eşleştirme' eklentisini kullanarak yığındaki görüntüleri hizalayın. Adım 1.10'da oluşturulan görüntü yığınını açtıktan sonra ImageJ'de aşağıdaki komut dizisini kullanın: Eklentiler → Şablon Eşleştirme → Yığındaki Dilimleri Hizalama → Tamam. Sonuç olarak görüntü yığınını kaydedin. Aşağıdaki adımlarda bu yeni görüntü yığınını kullanın.
    2. PIV (parçacık görüntü hızı) eklentisini kullanarak yer değiştirme alanını elde edin (Şekil 2D). Adım 1.11.1'de kaydedilen görüntü yığınını açtıktan sonra aşağıdaki komut dizisini kullanın: Eklentiler → PIV → Yinelemeli PIV (Temel) → Tamam → Bu PIV→'i kabul edin ve Tamam çıktısını alın. PIV çıktısını, orijinal görüntü yığınındakiyle aynı dizine kaydedin. Bunu bir sonraki adımda giriş olarak kullanın.
    3. Son olarak, çekiş haritasını elde etmek için FTTC (Fourier dönüşümü çekiş sitometrisi) eklentisini kullanın (Şekil 2E). Aşağıdaki komut sırasını kullanın: FTTC → eklentiler → Malzeme özelliklerini, yani Young modülü ve Poisson'un PA jel → oranını ekleyin Tamam → Adım 1.11.2'de kaydedilen PIV çıktı dosyasını seçin → Tamam. FTTC sonuçlarını, görüntü yığını ve PIV çıktısındaki ile aynı dizine kaydedin.

Results

Şekil 1. Farklı sertlikteki jeller ve polistiren tabak üzerinde başarılı birincil insan kolon hücre kültürü (hem kanser hem de normal). Faz kontrast görüntüleri, (A) Tümör hücrelerinin ve (B) Farklı sertlik substratları üzerindeki Normal hücrelerin tipik morfolojisini gösterir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pbs	Fransa	17-516F
Tripsin	Worthington	LS003736
Akrilamid	Sigma-Aldrich	A4058
N-metilenbisakrilamid (bis)	Sigma-Aldrich	M1533
İnsan fibronektini	BD biyolojik bilimler	354008
0,1 μm akışkan boncuklar	Yaşam teknolojileri	F8801
% 0.25 Tripsin-EDTA	Yaşam teknolojileri	25200-056
12 mm2 cam kapak astarı	Corning	2865-12