Hücre İskeleti ve Fokal Adezyon Organizasyon Testi: Hücre Adezyonunu ve Substratlar Üzerine Yayılmasını İncelemek İçin İmmünofloresan Tabanlı Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Ali, M. Y ve ark., Primer İnsan Kolon Tümörü Hücrelerinin Cerrahi Dokulardan İzole Edilmesi ve Traksiyon Sitometrisi için Doğrudan Yumuşak Elastik Substratlar Üzerinde Kültürlenmesi. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu videoda, substrat sertliğine bağlı olarak varyasyonlarını anlamak için birincil insan kolon kanseri hücrelerinde hücre iskeleti ve fokal adezyonları inceleme tekniği açıklanmaktadır. Yumuşak ve sert substratlar üzerindeki bu kanser hücresi kültürü, kanser prognozu için çeşitli aşağı akış biyofiziksel ölçümlere izin verir.

Protokol

>1. İmmünofloresan Mikroskopi Deneyleri

1. İmmün boyanacak hücrelerin bulunduğu substratları laminer davlumbaza alın ve kültür ortamını çıkarın.
2. Substratları PBS ile durulayın ve hücreleri RT'de 20 dakika boyunca PBS'de% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
3. Alt tabakaları PBS ile üç kez yıkayın (her seferinde 5 dakika). Sonuç olarak, substratları 500 μl sinyal arttırıcı ile 30 dakika inkübe edin ve PBS ile durulayın.
4. Hücreleri, RT'de 45 dakika boyunca PBS'de 1: 250 seyreltmede monoklonal anti-vinkülin antikoru ile inkübe edin. Ardından, alt tabakaları PBS ile 3 kez yıkayın (her seferinde 5 dakika).
5. Numuneleri ikincil antikor Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG ile RT'de PBS'de 1:200 seyreltmede 30 dakika inkübe edin. Alt tabakaları PBS ile 3 kez yıkayın (her seferinde 5 dakika).
6. F-aktin yapısını görselleştirmek için, hücreleri RT'de 45 dakika boyunca 50 μg / ml konsantrasyonda TRITC phalloidin konjugatları ile inkübe edin. Ardından, alt tabakaları PBS ile 3 kez yıkayın (her seferinde 5 dakika).
7. Numuneleri konfokal taramalı lazer mikroskobu kullanarak görüntüleyin (Şekil 1A-1D).

Sonuçlar

Şekil 1. Yumuşak jel ve sert polistiren substratlar üzerinde F-aktin ve vinkülinin immünofloresan boyanması.Yumuşak 2 kPa jeller üzerinde daha az yayılan (A1) tümör hücresinde veya (A2) normal hücrede aktin lifi mevcut değildi. Bununla birlikte, yumuşak jeller (B1-B2) üzerinde punktat vinkülin içeren fokal yapışmalar mevcu...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif
Pbs	Fransa	17-516F
Paraformaldehit	Elektron Mikroskobu Bilimleri	RT15710
Sinyal arttırıcı	Yaşam teknolojileri	I36933 Serisi
Monoklonal anti vinkülin antikoru	Sigma-Aldrich	V9131
Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG	Yaşam teknolojileri	A11001
TRITC falloidin konjugatları	Sigma-Aldrich	P1951 Serisi
Malzeme
12 mm2 cam kapak astarı	Corning	2865-12

Gazetesi Serisi Serisi Gazetesi