Donmuş Cilt Dokusu Blok Hazırlama: Murin Dorsal Deriden Kutanöz Melanom Örneklerini Korumak İçin Bir Protokol

Özet

Kaynak: Moon, H., et al. Mutant Melanosit Kök Hücrelerinden Murin Melanom Başlangıcının Mekansal ve Zamansal Kontrolü. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, melanom içeren murin dorsal cildinin izole edilmesi için ayrıntılı protokol ve ardından donmuş bir cilt dokusu bloğu hazırlamak için kriyo gömme işlemi açıklanmaktadır. Kriyo-gömülü doku bloğu, melanom ilerlemesini incelemek için kesitlere ayrılabilir ve mikroskobik olarak incelenebilir.

Protokol

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Doku İşleme

1. Cilt izolasyonu
   1. Başlamadan önce aşağıdakileri edinin: nekropsi aletleri, filtre kağıdı ve kağıt havlular.
   2. Fareleri onaylanmış protokollere göre ötenazi yapın ve devam etmeden önce ölümü onaylayın.
   3. Bir saç kesme makinesi kullanarak, sırt derisi bölgesindeki tüm tüyleri tıraş edin. Alanı temizlemek için alanı tüy bırakmayan bir mendille hafifçe fırçalayın.
   4. Kuyruğun tabanının hemen üzerinde keskin bir makasla küçük bir kesi yapın.
   5. Kesi içine büyük künt makas sokun ve deri altı bağ dokularını ayırın.
   6. Dokunun kenarı boyunca keskin bir makasla keserek ilgilenilen cilt bölgesini dikkatlice izole edin.
   7. Cilt dokusunu temiz bir kağıt havlu üzerine yerleştirin ve cildi havluya yapışacak ve gergin olacak şekilde germek için donuk forseps kullanın. Bu adım, dokusunun şeklini korurken manipüle edilebilmesi ve işlenebilmesi için dokuya ek destek sağlamaya hizmet eder.
      not: Forseps ciltte histolojik olarak görülebilecek hasara neden olabileceğinden, cilt dokusunun sadece dış bölgelerini tutmaya dikkat edin.
2. Doku fiksasyonu
   1. Bir parça filtre kağıdını ikiye katlayın ve uygun şekilde etiketleyin. Cildi, kağıt havlu sırtıyla birlikte kırışıklığın hemen yanındaki katlanmış kağıda yerleştirin, numunenin pürüzsüz olduğundan ve katlanmadığından veya buruşmadığından emin olun. Açık kenarları zımbalayarak filtre kağıdını kapatın ve ardından kalan kağıdın gelecekteki numuneler için kullanılabilmesi için kesin.
      not: Bu adım, sabitleme sırasında cildin şeklini koruması için gerçekleştirilir.
   2. Doku örneğini oda sıcaklığında 3 ila 5 saat veya gece boyunca 4 ° C'de% 10 nötr tamponlu formalin içine tamamen daldırın.
   3. Fiksasyonu takiben, numuneleri formalinden çıkarın, deiyonize suda yıkayın (her biri 2x 5 dakika) ve doku blokları yapmaya devam edin. Cilt dokusundaki kalıntı materyali (yani artık kağıt) dikkatlice çıkarın.
3. Donmuş doku bloklarının yapılması (Şekil 1)
   1. Deri örneğinin kenarlarını pürüzlü olmayacak şekilde kesin ve ardından 3 sagital kesim yapın. Bu şeritlerin genişliği, kriyo kalıbın yüksekliğinden (5 mm) fazla olmamalıdır. Ardından, kriyo kalıbın genişliğinden (20 mm) daha uzun olmayan ve gömülebilen deri parçalarına sahip olmak için enine kesimler yapın. Sırt derisinin kalan yarısı ile tekrarlayın veya dokuyu diğer kullanımlar için saklayın (alternatif olarak, fiksasyondan önce yarısını kaydedin).
      not: Cilt parçalarını doğru yönde tutmak önemlidir.
   2. Kriyokalıbı (25 x 20 x 5 mm³) dikey yönde yönlendirin ve OCT'nin üzerine 4 ila 5 parça deri yerleştirin. Tüm parçalar yerine oturduktan sonra, cildin uzun kenarını kriyomoldun dibine getirmek için 2 çift ince forseps kullanın. Cilt şimdi kalıbın tabanına dik olarak OCT'de ayakta durmalıdır. Bu adım sırasında OCT içinde hava ceplerinin oluşumunu en aza indirmeye dikkat edin (Şekil 1).
   3. Kalıbı OCT ile ikinci dudağa kadar doldurun ve kuru buzun düz yüzeyine yerleştirin. Blok donmaya başladığında aktarım sırasında kaymış olabilecek cilt parçalarını ayarlamak için forseps kullanın. Alt tabaka katılaştıktan sonra, dokuların manipülasyonu imkansız olacaktır.
   4. Analiz için 8-10 μm'lik slaytları kesin.
4. Formalin Sabit Parafin Gömülü (FFPE) doku bloklarının yapılması
   1. 2 parça sabit cildi etiketli bir kasete yerleştirin ve artan etanol konsantrasyonlarında dehidrat edin (30 dakika boyunca% 75 etanol, 30 dakika boyunca% 85, 30 dakika boyunca% 90, 30 dakika boyunca% 95, 2x 30 dakika boyunca% 100, 2x 30 dakika için Ksilen veya ksilen ikamesi). Parafin ile 58-60 ° C'de, önce 30 dakika ve sonra gece boyunca inkübe edin.
   2. Dokuyu sıvı parafinli 24 x 24 mm² paslanmaz çelik doku kalıbına gömün ve -5 °C'de katılaşın. Doku oryantasyonu, donmuş doku bloklarınınkine benzer olmalıdır, böylece birden fazla saç folikülü boyunca uzunlamasına kesitler görselleştirilebilir (Şekil 1).
   3. Parafin katılaştıktan sonra kalıbı çıkarın ve analiz için 5-10 μm'lik bölümler halinde kesin.

Sonuçlar

Şekil 1: Cilt dokusu izolasyonu ve kriyo-gömme. Ötenaziyi takiben, farenin dorsal derisini ilgilenilen bölgeyi tıraş edin ve cildi OCT içeren kriyomolda gömün. Farenin üzerindeki noktalı çizgi orta çizgiyi temsil eder. Tipik olarak, 3 veya 4 parça deri, orta hat boyunca 3-4 çizgi segmenti ile izole edilebilir; Böyle bir parça 1/2/3/4 dikdörtgeni ile gösterilir. Bu deri parçaları, şekilde gösterildiği ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Evcil hayvan saç düzeltici	Ayhan	09990-502
Tüy dökücü krem	Nair (Türkçe)	Yok	Çoğu eczanede bulunur
Pamuklu çubuklar	çeşitli
Ultraviyole ampul	UVP (Nükleer Enerji)	95-0042-08	model XX-15M orta kademe UV lambası
200 geçirmez etanol	çeşitli		saf etanol
Histoplast PE	Balıkçı Bilimsel	22900700	Parafin Peletleri
Nötr Tamponlu Formalin, %10	Sigma	HT501128-4L
O.C.T. Bileşiği	Termo	23730571
Doku Kaseti	Sakura Dili	89199-430	FFPE işleme için
Kriyo Kalıplar	Sakura Dili	4557	25 x 20 mm
FFPE metal kalıp	Leica Belediyesi	3803082	24 mm x 24 mm
İzofluran	çeşitli		Veteriner sınıfı
Anestezi inhalasyon sistemi	çeşitli		Veteriner sınıfı
İnce makas	FST (Türkçe)	14085-09	Düz, keskin/keskin
İnce makas	FST (Türkçe)	14558-09	Düz, keskin/keskin
Forcep	FST (Türkçe)	11252-00	Dumont #5
Forcep	FST (Türkçe)	11018-12	Mikro-Adson
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten f/f	Jackson Laboratuvarları	13590
LSL-tdDomates	Jackson Laboratuvarları	7914	ai14

Serisi