Hasta Kaynaklı Ksenogreft Modellemesi: Melanom Fare Modelleri Oluşturmak İçin Bir Teknik

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Fare implantasyonu için tümör dokusu işleme

1. Cerrahi eksizyon veya cerrahi biyopsi doku işleme
   1. Dokuyu steril bir Petri kabına aktarın ve tümör dokusunu çevredeki normal dokudan mümkün olduğunca ayırın.
   2. Nekrotik dokuyu (genellikle tümörün merkezinde bulunan soluk beyazımsı doku olarak tanımlanır) kalan tümörden mümkün olduğunca çıkarın.
   3. Cerrahi fare implantasyonu için ilk tümör yığınını yaklaşık olarak eşit parçalara (~ 3 mm x 3 mm) bölmek için bir neşter kullanın (Şekil 1).
   4. İsteğe bağlı olarak, yeterli tümör dokusu mevcutsa, aşağı akış tahlilleri için dokuyu dondurun (RNA dizilimi [RNASeq], tüm ekzom dizilimi [WES], vb.).
   5. İki neşter bıçağı ile çapraz bıçak tekniği kullanarak tümör dokusunu kıyarak bir tümör bulamacı yapın. Artık cerrahi fare implantasyonu için hazır olan bir bulamaç oluşturmak için tümör parçalarını mümkün olduğunca ince kıyın.
   6. Alternatif olarak, tümör dokusu mekanik ayrışma için çok sertse, jel benzeri bir bulamaç ve implantasyon ve / veya enjeksiyon için tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için bir sindirim ayrışma prosedürü kullanın.
      1. Bir bulamaç oluşturmak için tümör parçalarını mümkün olduğunca ince kıyın.
      2. Bulamacı soğuk Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile 50 mL'lik bir tüpe koyun-^/- (Ca⁺⁺ ve Mg⁺⁺ olmadan); daha sonra peleti 220 x g'da 4 ° C'de 4 dakika santrifüjleyin.
      3. Bulamacı, 1 g tümör dokusu başına 10 mL ısıtılmış taze sindirim ortamında (200 U / mL kollajenaz IV + 5 mM CaCl₂ + HBSS-^/-'de 50 U / mL DNaz) yeniden süspanse edin.
      4. Tüpü 20 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin ve her 5 dakikada bir tek kullanımlık bir pipetle kuvvetlice karıştırın.
      5. 50 mL'ye kadar HBSS-^/- ile yıkayın; daha sonra, 4 ° C'de 4 dakika boyunca 220 x g'de santrifüjleyin.
      6. 1 g tümör dokusu başına 5 mL önceden ısıtılmış TEG (%0.025 tripsin + 40 μg/mL etilen glikol-bis (β-aminoetil eter)-N, N, N', N'-tetraasetik asit [EGTA] + 10 μg/mL polivinil alkol [PVA]) ekleyin, hafifçe yeniden süspanse edin/çalkalayın ve tüpü karıştırmadan 2 dakika boyunca 37 ° C'ye yerleştirin.
      7. En az 1 eşit hacimde soğuk boyama ortamı ekleyin (% 1 sığır serum albümini [BSA] + 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit [HEPES] + L15 ortamında 1x penisilin-streptomisin) tripsini söndürmek için ve 220 x g'da 4 ° C'de 4 dakika boyunca santrifüjleyin.
      8. Numuneyi 1 g tümör dokusu başına 10 mL boyama ortamında yeniden süspanse edin ve fare enjeksiyonu için tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için 40 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün (Şekil 1).
      9. Hücre süzgecinin üstünde kalan bulamaç da cerrahi fare implantasyonu için toplanabilir.
2. Farelerde tümör implantasyonu ve enjeksiyonu
   1. Cerrahi eksizyon veya cerrahi biyopsi dokusunun implantasyonu
      not: Tüm cerrahi aletlerin otoklavlama veya önceden sterilize edilmiş tek kullanımlık aletler kullanılarak steril olduğundan emin olun.
      1. NSG 6-8 haftalık erkek veya dişi farelerin alt sırtından saçları tıraş edin ve yaklaşık 1,5 cm x 3 cm'lik bir alanı saçsız bırakın. İzofluran kullanarak fareleri uyuşturun ve yanıt verme testi olarak ayağınızı hafifçe sıkarak onaylayın. Kuruluğu önlemek için gözlerine veteriner merhemi kullanın.
      2. Tek tek fareleri anestezi makinesinin burun konisindeki bir ısı yastığına yerleştirin, traş edilmiş alanı klorheksidin ile ovalayın. Ardından, %70 etanol ile ıslatın ve buharlaşmasına izin verin.
      3. Cerrahi implantasyon için parçalar hazırlayın veya bir Petri kabındaki tümör bulamacını ayrı höyüklere bölün (yani, 3 fareye implante edilecekse üç eşit höyüke).
      4. Neşter bıçağını kullanarak, farenin sırtının ortasında yaklaşık 5 mm uzunluğunda bir kesi yapın, bir çift forseps alın ve operatörün karşısındaki kesi tarafındaki cildi yukarı kaldırın.
      5. Makası diğer elinize alın ve fasyal zarı küçük makas kesikleriyle nazikçe keserek cildi kas tabakasından ayırın, böylece tümör dokusu için bir "cep" oluşturun.
      6. Neşter bıçağıyla bir tümör yığını veya bir ayrı tümör bulamaç dokusu höyüğü alın ve dokuyu oluşturulan cebe yavaşça yerleştirin.
      7. Cepteki tümör dokusu höyüğüne 100 μL yapay hücre dışı matris uygulayın.
      8. İki çift forseps kullanarak, yara kenarları birbirine yaklaşacak şekilde her iki uçtaki kesiyi yukarı çekin ve bir veya iki yara klipsi uygulayarak yarayı kapatın.
      9. Ameliyattan sonra farelerde analjezik olarak deri altına 1-5 mg / kg meloksikam enjekte edin.
      10. Fareyi burun konisinden çıkarın ve orijinal kafesine geri yerleştirin; uyanırken fareyi gözlemleyin. Tamamen iyileşene kadar kafese geri dönmeyin.
      11. Yara klipslerini yaklaşık 7 gün sonra çıkarın. 7 gün sonra iyileşme tamamlanmazsa, yara klipsini bir veya iki gün daha bırakın.
          not: Cerrahi eksizyon veya cerrahi biyopsi doku işlemeden tek hücreli bir süspansiyon kullanılıyorsa, fare enjeksiyonu için yapay hücre dışı matris (1: 1 oranında) ile karışacaktır.
   2. İİAB veya çekirdek biyopsi dokusu enjeksiyonu
      1. NSG fareyi çelik ızgara rafına yerleştirin, fareyi kuyruğundan sıkıca tutun ve fareyi yavaşça geri çekin. Ön ayakları ile ızgarayı sıkıca kavrayacaktır. Alternatif olarak, fareyi baskın olmayan elinizde tutun ve yan alanın görünmesine izin verin.
      2. Yan cildi alkol hazırlama çubuklarıyla dezenfekte edin. Şırınganın içeriğini farenin derisinin altına yavaşça ve düzenli bir şekilde enjekte edin.
      3. İğneyi dışarı çekin ve fareyi kafesine geri yerleştirin.
3. Tümör büyümesini izleyin
   1. Palpe edilebilen tümörleri kontrol etmek için fareleri haftada bir kez izleyin.
   2. Tümörler ölçülebilir bir boyuta ulaştığında (yaklaşık 50 mm³), tümör boyutlarını kaydetmek için bir kumpas kullanın. Tümör hacimlerini hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın: (genişlik x genişlik x uzunluk) / 2.
   3. Tümör hacmi yaklaşık 1,5^cm3'e ulaştığında (yaklaşık 4-10 hafta) tümörü çıkarın. Tümör artık fare pasajı 1 (MP1) olarak adlandırılıyor.

Şekil 1: Alternatif implantasyon yöntemleri.(A) Tümörler, parçalar halinde, bir bulamaç süspansiyonu veya tek hücreli bir süspansiyon olarak işlenebilir. (B) Her üç yöntem de in vivo olarak tümörlerin büyümesine izin verecektir. Burada gösterilen, deri altına tümör implante edilen ve implantasyondan 12 gün sonra görüntülenen farelerdir. (C) Üç implantasyon yönteminden biri ile enjekte edilen fareler için tümör büyüme eğrileri gösterilmiştir. N = kol başına 5; Hata çubukları standart hatadır.