Asılı Damla Yöntemi: 3D Melanom Sferoidleri Oluşturmak İçin Bir Teknik

1. Asılı Bırakma Yöntemi ile 3D Melanom Sferoidlerinin Üretilmesi

1. Kültür melanom hücreleri (ör., 451-LU veya ilgilenilen herhangi bir melanom hücre hattı) genel protokollere göre,% 10 FCS içeren RPMI kullanarak.
   1. Benzer boyut ve kalitede melanom sferoidleri oluşturmak için, melanom hücrelerini PBS'de yıkayın, bir T175 hücre kültürü şişesindeki hücrelere PBS'de 5 mL 1x Tripsin-EDTA ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 3-5 dakika inkübe edin. 5 mL RPMI /% 10 FCS ekleyerek Tripsin'i nötralize edin. Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleme ile hasat edin. Hücre peletini, bir hemositometrede sayılarak belirlendiği gibi 10.000 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyonda RPMI/FCS'de yeniden süspanse edin.
2. Hücre süspansiyonunun 40 x 25 μL'sini (= 250 hücre) steril, yapışkan olmayan bir hücre kültürü kabının (Ø 10 cm) kapağının iç yüzeyine elektronik bir çoklu pipet kullanarak yerleştirin. Hızlı ama yumuşak bir hareketle kapağı ters çevirin ve 5 mL PBS içeren ilgili hücre kültürü kabına yerleştirin.
   1. Kullanılan hücre tipine bağlı olarak 10-14 gün boyunca 37 ° C ve% 5 CO_2'de bir hücre inkübatöründe "asılı damla tabakları" kültürü.
      not: Metastatik melanom büyüme fazındaki hücreler tipik olarak daha hızlı büyür ve radyal büyüme fazından veya dikey büyüme fazından türetilen melanom hücrelerine kıyasla asılı damlada daha katı sferoidler oluşturur. Bireysel değerlendirme için, bir çift dürbün altında veya ışık mikroskobu altında (4X büyütme) küresel büyümeyi gözlemleyin. Genellikle, sferoidler bir çift dürbün altında veya ışık mikroskobu altında (4X büyütme) 48 saat sonra tespit edilebilir hale gelir. 10-14 gün sonra herhangi bir büyütme cihazı olmadan görünür hale gelirler.
3. İlk damla lekelenmesinden beş gün sonra, her damlaya 10 μL taze RPMI/%10 FCS ortamı ekleyin. Daha sonra, her gün 10 μL ortam değiştirin. Elektronik bir dağıtıcının kullanılması bu adımda çok faydalıdır.
4. Hücre tipine bağlı olarak, sferoidleri 10-15 gün sonra hasat edin. PBS ile asılı damla hücre kültürü kabının kapağındaki sferoidleri dikkatlice durulayın. Steril, yapışkan olmayan bir hücre kültürü kabında 10-20 sferoid toplayın. Fazla PBS'yi bir Pasteur pipeti ile dikkatlice çıkarın.
   not: Yetiştirme periyodu, melanom hücrelerinin başlangıçta türetildiklerinde tümör büyüme aşamasına bağlıdır, örneğin, 451-LU hücrelerinden türetilen sferoidler, asılı damlada kültürlenmeden sonraki 12 gün içinde yaklaşık 500 μm çapa kadar büyür.