Organotipik Tam Cilt Rekonstrüksiyonlarının Oluşturulması: İnsan Derisi Örneklerini Kullanarak 3D Cilt Modeli Oluşturma Prosedürü

Özet

Kaynak: Müller, I. et al. Bir 3D Organotipik Melanom Küresel Cilt Modeli. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, melanom ilerlemesini incelemek için in vitro 3D organotipik cilt rekonstrüksiyonları oluşturmak için ayrıntılı protokol açıklanmaktadır. Bu cilt modeli, in vivo organların hem mimarisini hem de çok hücreli karmaşıklığını taklit eder.

Protokol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Primer Keratinositlerin Epidermisten İzolasyonu

1. Epidermal dokuyu PBS ile yıkayın. Epidermisi daha küçük parçalar halinde (1 mm²) kesin ve 50 mL'lik konik bir tüpte toplayın. 10 mL 1x Tripsin-EDTA (önceden 37 °C'ye ısıtılmış) ekleyin ve 37 °C'de bir su banyosunda 5 dakika inkübe edin. Doku süspansiyonunu her 2 dakikada bir girdaplayın.
2. 1 mL fetal buzağı serumu (FCS) ekleyerek enzimatik reaksiyonu durdurun. 10 mL'lik plastik bir pipetle 4 dakika boyunca yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri yeniden süspanse edin. Kabarcıklardan ve köpük oluşumundan kaçınmaya çalışın.
3. Hücre süspansiyonunu, taze 50 mL konik bir tüpün üzerine yerleştirilmiş bir hücre süzgecine (gözenek boyutu 100 μm) pipetleyin ve 3x'i 5 mL PBS ile durulayın. Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Hücre peletini %1 (h/h) gentamisin içeren 2-6 mL kültür ortamında yeniden süspanse edin. Bir hemositometredeki hücreleri sayarak hücre sayısını manuel olarak belirleyin ve 6 x 10⁵ hücreyi bir T75 hücre kültürü şişesine tohumlayın.

2. Dermisten Primer Fibroblastların İzolasyonu

1. Dermal dokuyu daha küçük parçalar halinde (1 mm²) kesin ve bunları 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. 10 mL kollajenaz çözeltisi (PBS ⁺ 'da 5 U / mL) ekleyin ve 37 ° C'de bir su banyosunda 45 dakika inkübe edin. Doku parçaları ve hücrelerin karışımını 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
2. Hücre peletini 4.5 g / L glikoz ve L-Glutamin içeren 10 mL DMEM ile iki kez yıkayın, ancak L-Piruvat olmadan. Son olarak, doku parçalarını %1 (h/h) gentamisin ve %10 FCS içeren 2 mL DMEM'de yeniden süspanse edin. Bunları bir T25 hücre kültürü şişesine aktarın ve gece boyunca 37 ° C ve% 5 CO_2'de bir hücre inkübatöründe inkübe edin><. NOT: Küçük hacim, fibroblastların doku kalıntılarından dışarı çıkmasına izin verir ve onları kültür şişesine yapışmaya zorlar.
3. Ertesi sabah, 6 mL daha DMEM/Gentamisin/FCS ekleyin ve hücreler %80-90 birleşmeye ulaşana kadar 37 ° C'de 2-3 gün inkübe edin.

>3. Organotipik Tam Deri Rekonstrüksiyonlarının Dermal Kompartmanının Oluşturulması

1. 24 oyuklu plakalara yerleştirilmiş 24 oyuklu hücreli mikro gözenekli membran ekleri (gözenek boyutu 8 μm) kullanarak cilt modelleri oluşturun.
   not: Asılı ancak ayakta duran ekler kullanmadığınızdan emin olun, çünkü bunlar daha sonraki bir aşamada hava-sıvı ekimi için 6 oyuklu bir plakaya yerleştirilecektir.
2. Jel nötralizasyon solüsyonunun (GNL) yanı sıra MM ve endotelyal büyüme ortamı (EGM) olarak adlandırılan kültür ortamını hazırlayın. Pıhtılaşmayı önlemek için, kollajen tip I'i (genellikle sıçan kuyruğundan, 0.02 N asetik asit içinde 3.5-4 mg / mL) RT'de jelleşmeye başladığı için kullanana kadar buz üzerinde saklayın.
3. GNL'de insert başına 1 x 10⁵ fibroblastı yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 500 μL/insert'lik bir son hacimde 1: 3 oranında kollajen ile hızlı bir şekilde karıştırın. Kabarcık oluşumunu önlemek için nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın, çünkü kabarcıklar cildin yeniden yapılandırılmasının kalitesini bozabilir.
4. Tek tek dermal jelleri steril bir başlıkta 30 dakika boyunca RT'de ortam olmadan tutarak çökelmesine izin verin. Daha sonra, her bir jeli 4.5 g/L glikoz, %1 L-glutamin, %10 FCS içeren ve L-piruvat içermeyen DMEM ile kaplayın ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.

4. Organotipik Tam Deri Rekonstrüksiyonlarının Epidermal Bölmesinin Oluşturulması

1. Ertesi gün, besiyerini dermal jellerden çıkarın ve 37 ° C'de 2 saat boyunca EGM ortamı (% 10 FCS,% 1 PenStrep, 10 mg / mL gentamisin) ile dengeleyin. Ortamı geri çekin ve dermal jelin üzerine 100 μL EGM içinde yeniden süspanse edilmiş 1 x 10⁵ keratinositleri dikkatlice tohumlayın.
2. Keratinositlerin dermal bölmeye yapışmasını sağlamak için rekonstrüksiyonları 37 ° C'de 1,5 saat inkübe edin.
   not: Bu inkübasyon süresi boyunca, jeller fibroblastın neden olduğu kasılma nedeniyle büzülmeye başlayacak ve böylece ek duvarlardan en azından kısmen ayrılacaktır.
3. Cilt eşdeğerlerini yaklaşık 800 μL EGM ile örtün ve kalan jeli küçük (beyaz) bir pipet ucuyla ek duvardan dikkatlice çıkarın. 37 ° C,% 5 CO_2'de bir hücre inkübatörde 7 gün boyunca EGM'ye batırılmış cilt eşdeğerlerini kültürleyin ve ortamı her gün değiştirin.
   not: Bu süre zarfında, cilt eşdeğerleri önemli ölçüde küçülecektir.

>5. Organotipik Tam Deri Yeniden Yapılandırmalarının Hava-Sıvı Kültivasyonu

1. 8. günde, her bir eki 6 oyuklu bir plakanın ayrı bir kuyucuğuna aktarın. Her oyuğa sadece 1.2-1.4 mL MM besiyeri ekleyin, böylece cildin yeniden yapılandırılması kuyucuğun dibinden besiyeri ile beslenir, ancak besiyeri ile kaplanmaz.
   not: Hava-sıvı arayüzünde ekim, epidermal kısmın tabakalaşmasına ve tam bir kornifiye tabakanın (stratum corneum) oluşturulmasına izin verir.
2. Önümüzdeki 10-17 gün boyunca, ortamı bölüm 5.1'de belirtildiği gibi her gün değiştirin. Bu süre zarfında, ortama gerektiği kadar ilaç veya başka uyaranlar ekleyin. Daha fazla analiz için, örneğin immünohistokimyasal analiz (Şekil 1) için kavisli cımbız kullanarak mikro gözenekli membran ekinden tam cilt rekonstrüksiyonunu dikkatlice çıkarın.

Sonuçlar

Şekil 1: 3D organotipik derinin yetiştirilmesi, ortama batırılmış ve hava-sıvı arayüzünde yeniden yapılandırılır. 0. günde, primer keratinositler, bir kollajen tip I matrisine gömülü primer fibroblastlardan oluşan dermal bölmenin üzerine ekilir. 3D cilt rekonstrüksiyonları, 7 gün boyunca EGM ile su altında ekilir, ek duvardan ayrılır ve küçülmeye başlar. 8. günde, ekler 6 kuyucuğa aktarılır ve epiderm...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
fetal serum albümini (FCS)	Thermo Fisher Bilimsel	10270106	Hücre kültürü ortamına% 10 ekleyin
Tripsin-EDTA	Thermo Fisher Bilimsel	25300054	PBS'de 1X seyreltin
DMEM (Ömer Çiçeğ	Thermo Fisher Bilimsel	41965062	primer fibroblastların yetiştirilmesi için
Dağıtma	Gibco yaşam teknolojileri	17105041	2U/ml, PBS'de çözün
Kollajen tip I	BD Biyolojik Bilimler	354249	Genellikle sıçan kuyruğundan elde edilen konsantrasyon 3.5-4 mg / ml olmalıdır
24 oyuklu Nunclon ekler	Nunc (Rahibe)	140629	8 μm gözenek boyutu; asılı değil, ayakta duran ekler kullanın
hücre süzgeci	BD Şahin	352360	sarı
Gentamisin	Thermo Fisher Bilimsel	15750060	PBS'de çözülür
Keralife keratinsiit ortamı	Hücre Sistemleri		FCS veya antibiyotik eklemeyin
Kollajenaz	SERVA	17454	NB4 standart sınıf
Juvenil insan keratinositleri	Hücre Sistemleri	FC-0007	Juvenil sünnet derisinden kendi hazırlığına alternatif
Juvenil insan fibroblastları	Hücre Sistemleri	FC-0001	Juvenil sünnet derisinden kendi hazırlığına alternatif
EGF (Türkçe)	Gibco yaşam teknolojileri	13247-051	sadece EGM besiyeri üretimi için 10 ng/ml ekleyin
Kalsiyum klorür	Merck Kimyasalları	2381	EGM üretimi için 1,9 mM ve MM ortamı için 3,8 mM ekleyin
Selenik asit	Alfa Aesar	18851	EGM ve MM ortamı üretimi için 53 nM ekleyin
Insülin	Lilly	HI0219 Uğultu Kalemi 3ml 100 E.I./ml	EGM ve MM ortamı üretimi için 5 μg/ml ekleyin
Etanolamin	Sigma-Aldrich	E-0135	EGM ve MM ortamı üretimi için 0,1 mM ekleyin
P-Etanolamin	Sigma-Aldrich	P-0503	EGM ve MM ortamı üretimi için 0,1 mM ekleyin
Holo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T-0665	EGM ve MM ortamı üretimi için 5 μg/ml ekleyin
Triiyodotironin	Sigma-Aldrich	T-6397	EGM ve MM ortamı üretimi için 20 pM ekleyin
Hidrokortizon	Sigma-Aldrich	H-088816	EGM ve MM ortamının üretilmesi için 0,4 μg/ml ekleyin
Progesteron	Sigma-Aldrich	P-8783 Serisi	sadece EGM ortamının üretilmesi için 10 nM ekleyin
Hepes Belediyesi	Sigma-Aldrich	H-3784	EGM ve MM ortam üretimi için 15 mM ekleyin
Serin	Sigma-Aldrich	S-4311 Serisi	EGM ve MM ortamı üretimi için 1 mM ekleyin
Kolin klorür	Sigma-Aldrich	Cı-7017	EGM ve MM ortamı üretimi için 0,64 mM ekleyin
dFCS (dFCS)	Sigma-Aldrich	F-0392 Parsel 086K0361	EGM ve MM ortamı üretimi için %2 ekleyin
Adenin	Sigma-Aldrich	A-9795	EGM ve MM ortamı üretimi için 0,18 mM ekleyin
L-Glutamin	Promosyon Hücresi	C-42209	EGM ve MM ortam üretimi için 7,25 mM ekleyin
Stronsiyum klorür	Sigma-Aldrich	255521	EGM ve MM ortamı üretimi için 1 mM ekleyin

Serisi Serisi Adet Gazetesi Teslim Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi Serisi Gazetesi