$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. B16-BL6 Hücrelerinin Hazırlanması
- Hücre kültürü plakalarını 37 derecelik inkübatörden çıkarın ve steril bir başlık içine yerleştirin. Plakalar B16-BL6 murin melanom hücreleri ile yaklaşık% 70 oranında birleşik olmalıdır. Daha büyük bir birleşme, hücrelerin metastatik potansiyelini değiştirebilir.
- Plaka başına 1 mL% 0.05 Tripsin-EDTA ekleyin, 1 dakika bekletin ve ardından tripsin-medya solüsyonunu aspire edin.
- Plaka başına 1 mL tripsin ekleyin ve plakaları 10 dakika boyunca inkübatöre geri koyun.
- Plakaları inkübatörden steril davlumbaza taşıdıktan sonra, her plakaya 4 mL serumsuz Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) ortamı ekleyin.
- Hücreleri steril, motorlu bir pipetle toplayın. Hücreleri parçalamak için ucu çok hafif bir açıyla bastırarak hücreleri plakanın altına doğru çıkarın. Aksi takdirde ejeksiyon iğnesini tıkayabilecek hücre kümelerinin yeterli şekilde ayrılmasını sağlamak için birkaç kez tekrarlayın. Hatırlayın ve 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
- Hücre yoğunluğunu belirlemek için bir hemositometre kullanın. Toplam B16-BL6 hücre sayısını sabit tutarak, 0, 0.065, 0.015, 0.25 ve 0.5 milyon hücre / mL'lik nihai konsantrasyonlara ulaşmak için gereken serumsuz RPMI hacmini belirleyin.
- 50 mL'lik tüpteki ortamı 15 mL'lik konik tüplere eşit olarak ayırın. Konik tüpleri 2.250 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Medyayı boşaltın. Uygun hacimde serumsuz RPMI ekleyin ve istenen hücre yoğunluğunu hemositometre ile onaylayın. Ek RPMI ekleyerek veya döndürerek ve buna göre daha küçük bir hacimde yeniden askıya alarak yoğunlukları ayarlayın.
- Her hücrenin 500 μL'sini buz üzerinde etiketli 1.8 mL'lik tüplere alıkoyun.
2. Kuyruk Damar Enjeksiyonu
- Dişi C57BL / 6 fare (6-8 haftalık), grup başına 5 fare satın alın. Farelerin alışması için birkaç gün bekleyin.
- Kuyruğundan tuttuğunuz bir fareyi alın ve önce fare tutucuya arkadan yönlendirin. Gövde tutucunun ana bölmesinde ve kuyruk dışındayken, fareyi tutucunun ucuna doğru çekin. Fare sabitlenene kadar itmeye devam ederek sınırlayıcı pistonu yerleştirin.
- Fareyi, yanal kuyruk damarlarından biri yukarı bakacak şekilde 90 derece döndürün. Alkollü bir ped kullanarak, farenin kuyruğunun yan tarafını, özellikle kuyruk damarının en görünür olduğu yeri kuvvetlice temizleyin.
not: B57BL/6J farelerde etkili kuyruk damarı görselleştirmesi için iyi aydınlatma şarttır. Isı lambaları veya ısıtılmış ameliyat pedleri, gerekli olmasa da, kuyruk damarının hacmini artırarak da yardımcı olacaktır.
- Steril bir kültür davlumbazında, 2 milyon hücre / mL tüpten 300 μL hücre kültürü ortamı toplayın. Şırıngadaki kabarcıkları çıkarmak için iğneyi ters çevirin, yandan hafifçe vurun ve pistonu itin. 250 μL'lik bir nihai hacim elde etmek için kültür-RPMI'yi çıkarın.
- Baskın olmayan elinizle fare kuyruğunu uzatın. Kuyruğu, kuyruğun proksimal ucu baskın olmayan elin işaret parmağı ile yukarıda ve kuyruğun distal kısmı başparmakla bastırılmış olarak tutun.
not: Bu şekilde, kuyruk damarı, kuyruğun daha distal kısmında uyumlu bir giriş mümkün olacak şekilde, sınırlayıcı yüzeye paralel olarak yanal bir pozisyonda tutulur.
- İğneyi kuyruk damarına, distal uca doğru, başlangıçta bir dakika aşağı doğru açıyla yerleştirin ve daha sonra yerleştirmenin ardından iğneyi kuyruk damarının açısına uyacak şekilde ayarlayın (şırınganın piston ucunu iğneye göre indirin).
- İğneyi kuyruk damarına yaklaşık 1 cm sokun. Yerleştirdikten sonra, iğneyi sabit tutarak pistonu itmeye başlayın.
not: İğne kuyruk damarındaysa ve iğnenin ucu tıkalı değilse, ortam damar içine engelsiz bir şekilde akmalıdır. Etkili bir enjeksiyon, damardan kan temizliği ile karakterizedir. Direnç varsa veya enjeksiyon bölgesinde bir kabarcık oluşmaya başlarsa, iğneyi çıkarın ve kuyruk damarı boyunca daha yakın bir yerde tekrar deneyin.
- İğneyi damardan çıkarın ve atın. Herhangi bir kanamayı durdurmak için gazlı bezi giriş yerine tutun.
- Pistonu tutucudan çıkarın ve fareyi alıcı kafesine yerleştirin.
- Diğer tüm konsantrasyonlar için tekrarlayın.
not: Akciğer odaklarının kurulması yaklaşık 2-3 hafta sürer, hücre hattına ve odakların istenen boyutuna bağlı olarak değişkenlik gösterir. Bu arada, fareler aşırı nefes nefese kalma gibi erken ötenaziyi garanti edebilecek semptomlar açısından izlenmelidir.
3. Akciğer Odaklarını Sayma
- Fareyi bir CO2 odasına yerleştirerek ve 5 dakika boyunca dakikada oda hacminin% 10-30'unda verilen% 100 CO2'ye maruz bırakarak ötenazi yapın. Servikal çıkık ile takip edin.
- Fareyi Strafor üzerine yayın. Cerrahi makas kullanarak, sternum boyunca cerrahi bir kesi oluşturun.
- Hem sternum kesisinin üstünden hem de farenin omuzlarına doğru dallanarak göğüs kafesini açığa çıkaran iki ek kesi yapın.
- Göğüs kafesini gövdeden çıkarmak, akciğerleri ve kalbi açığa çıkarmak için her biri sternumun yan tarafları boyunca iki kesim yapın.
- Kalbi cerrahi cımbızla tutarak, yemek borusunu ve nefes borusunu kesin, kalbi ve akciğerleri fareden kurtarın. Daha iyi görselleştirme için 10X büyütmeli bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.
- Kalbi akciğerlerden ayırın ve timusu çıkarın, sadece iki akciğeri bırakın.
- Akciğerler diseksiyon kapsamının altındayken, akciğer odaklarını saymaya başlayın. Her odak, akciğerlerin yüzeyinde dairesel, kahverengi bir tıkanıklık olarak görünmelidir.
- Fareler arasındaki tutarlılık için, bir lobun yüzeyindeki odak sayısını sayın ve ardından bu lobu ters çevirin. Dört lobun her birini ayrı ayrı yapmak, daha kolay sayma sağlar.
- IHC yapıyorsanız akciğerleri kaydedin ve düzeltin, aksi takdirde kalıntıları atın.