HCR-DNA FISH: Enfekte Hücrelerde Viral DNA'yı Tespit Etmek için Bir Floresan In Situ Hibridizasyon Tekniği

Özet

Kaynak: Wei Liu ve ark., Merkel Hücreli Polyomavirüs Enfeksiyonu ve Tespiti, J. Vis. Uzm. (2019).

Bu videoda, MCPyV viryonları ile enfekte olmuş hücreler, MCPyV'ye özgü genomları tespit etmek için in situ hibridizasyon zincir reaksiyonuna tabi tutuldu. Ayrıca, DNA-HCR tekniği, enfekte insan derisi hücrelerinde MCPyV DNA'sını görselleştirmek için FISH ile birleştirildi.

Protokol

1. Enfeksiyon

1. % 10 fetal buzağı serumu,% 1 esansiyel olmayan amino asitler ve% 1 L-glutamin ile DMEM'de birincil insan dermal fibroblastlarını koruyun. Birleşme noktasına ulaştıktan sonra, fibroblastları dönmeden 1: 4 oranında bölün.
   not: En yüksek MCPyV enfeksiyon verimliliği için, kaplama sırasında aktif olarak bölünen 5. ve 12. pasajlar arasında primer fibroblastlar kullanın.
2. İnsan dermal fibroblastlarını enfekte etmek için, ortamı aspire edin ve hücreleri DPBS ile yıkayın.
3. Tabağa 1 mL %0.05 Tripsin-EDTA ekleyin ve 37 ° C'de 5-10 dakika inkübe edin.
4. Hücrelerin tabaktan çıktığından emin olmak için mikroskop altında kontrol edin.
5. 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF ve 3 μM CHIR99021 içeren 10 mL DMEM/F12 ortamı ekleyin, bunların tümü MCPyV enfeksiyonunu uyarır ve hücre çözeltisini 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
6. Hücreleri 2 dakika boyunca 180 x g'da döndürün ve süpernatanı atın. 20 ng / mL EGF, 20 ng / mL bFGF ve 3μM CHIR99021 içeren DMEM / F12 ortamındaki hücreleri mL başına 2-4 x^{10 4} hücrede yeniden süspanse edin.
7. 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 mg / mL kollajenaz tip IV ile takviye edilmiş 200 μL hücre süspansiyonunun tohumu. MCPyV virion stoğunu buz üzerinde çözün. Enfekte olacak her 2.500 ila 5.000 hücre için 1 μL iyodiksanol başına 10⁹ viral genom eşdeğeri MCPyV virion ekleyin. Plakanın yan tarafına hafifçe vurun ve plakayı inkübatöre yerleştirin.
8. 48-72 saat boyunca% 5 CO₂ içinde 37 ° C'de inkübe edildikten sonra, her oyuğa% 20 FBS ekleyin.
9. Enfeksiyonun 72-96 saat boyunca% 5 CO₂ içinde 37 ° C'de ilerlemesine izin verin.

2. Yerinde DNA-HCR

1. Lameller üzerine kültürlenmiş hücreleri PBS'de %4 PFA ile 10 dakika sabitleyin. Lamelleri PBS ile iki kez yıkayın, ardından hücreleri gece boyunca 4 ° C'de geçirgen hale getirmek için% 70 etanol ile muamele edin.
   not: Sabit numuneler birkaç gün bu durumda kalabilir.
2. Etanolü prob hibridizasyon tamponu ile değiştirerek ve RT'de 60 dakika inkübe ederek numuneleri önceden hibridleyin.
3. Probu/propları (1 μM) (Tablo 1) prob hibridizasyon tampon çözeltisi içinde, ön hibridizasyon adımının bitiminden 30 dakika önce 1:500 seyreltmede seyreltin ve 45 °C'de inkübe edin.
4. İnkübasyonların sonunda, mikroskop lamları üzerine lamel başına ~ 10 μL seyreltilmiş prob karışımını pipetleyin. Lamelleri, hücre tarafı aşağı bakacak şekilde, hibridizasyon probu karışımının ilgili damlacıkları üzerine yerleştirin. Lamellerin kenarlarını ve arkalarını bol miktarda kauçuk çimento ile kızaklara kapatın.
5. Slaytları bir ısı bloğunun düz tarafına yerleştirerek slaytları ilave problarla 94 °C'de 3 dakika ısıtın. Slaytları nemlendirilmiş bir odaya aktarın ve gece boyunca 45 °C'de inkübe edin. Basit bir nemlendirilmiş oda yapmak için, steril kağıt havluları dH₂O ile hafifçe nemlendirin ve lastik bir conta ile kapatılan plastik bir kabın dibine yerleştirin.
   not: Isıtma sırasında, kauçuk çimento kısa bir süre kabarabilir. Ancak, contanın kırılmadığından emin olun.
6. Kauçuk çimentoyu forseps ile dikkatlice soyun ve lamelleri hücre tarafı yukarı bakacak şekilde 24 oyuklu bir plakanın kuyularına yerleştirin. Lamelleri RT'de prob yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.
7. Lameli amplifikasyon tamponunda (24 oyuklu plakalarda 200 μL) RT'de 30-60 dakika inkübe edin.
8. Bu arada, probları tanıyan iki etiketli oligonükleotid saç tokasının her birini (Tablo 1) ayrı PCR tüplerinde 94 saniye boyunca 90 ° C'ye ısıtarak ve ışıktan koruyarak 30 dakika RT'ye soğutarak tavlayın. İki saç tokasını, her biri 1:50 seyreltmede amplifikasyon tamponunda karıştırın.
9. Parafin filmi 24 oyuklu bir plaka kapağının açık yüzüne gererek amplifikasyon reaksiyonu için bir yüzey oluşturun. Her lamel için 50-100 μL saç tokası/amplifikasyon tamponu karışımından damlacıkları parafin film üzerine pipetleyin. Lamelleri ön amplifikasyon çözeltisinden dikkatlice çıkarmak için forseps kullanın. Kenarı gözenekli tek kullanımlık bir mendile dokundurarak lameli kurulayın ve hücre tarafı aşağı bakacak şekilde amplifikasyon damlacığının üzerine yerleştirin.
10. Lamelleri tutan plaka kapağını nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin ve karanlıkta RT'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.
11. Lamelleri bir kez daha kuyulara geri koyun. Numuneleri RT'de 1 saat boyunca 0,5 μg/mL DAPI içeren 5x SSCT [5x sodyum klorür sodyum sitrat (SSC):% 0,1 Tween 20, 0,22 μm'lik bir filtreden süzülmüş] ile inkübe edin. Numuneleri RT'de 5x SSCT ile iki kez yıkayın.
12. Lamelleri mikroskop lamlarına monte edin. Hücreleri analiz edin ve ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak numuneleri görüntüleyin.

MCPyV probu 1	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA tgagctacctcactaaggagtggttttgcagtttcccgccttg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV probu 2	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agaggcctcggaggctaggagccccaagcctctgccaacttgaaaaaa ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV probu 3	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cattgactcatttcctggagaggcggagtttgactgataaacaaaacttt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV probu 4	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gatactgccttttgctaattaagcctcttaagcctcagagtcctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV probu 5	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcttcctgtaagaatagcttccaaagttacctgtggtggcactt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV probu 6	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ggatgttgccataacaattaggagcaatctccaaaagcttgcacagagcc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV probu 7	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gctcaggggaggaaagtgattcatcgcagaagagatcctcccaggtgcca ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCACTCTCAC
MCPyV probu 8	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcctgggacgctgagaaggaccaccacccagaagagctctggctg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV probu 9	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agcttcggaccccccaaattttcgctttcttgagaatggagggggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV probu 10	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtgtctgcggcttgttggcaaatggttttgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV probu 1	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cagctctgtgcataactgtggtaactttttgtcgctcctgtgggtcct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCACTCTCAC
HPV probu 2	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA acaatattaatgggctctgtccggttctgcttgtccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV probu 3	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gtcagctatactgggtgtaagt�gtccaaatgcagcagcaaccctt CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV probu 4	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgcggcggggtggttggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV probu 5	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ccatccattacatcccgtaccctcttccccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC

Tablo 1: Çalışmada kullanılan problar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Prob hibridizasyon tamponu	Moleküler teknolojiler
Prob yıkama tamponu	Moleküler teknolojiler
Amplifikasyon arabelleği	Moleküler teknolojiler
Alexa 594 etiketli saç tokaları	Moleküler teknolojiler	B4	Işıktan koruyun
Paraformaldehit	Sigma	P6148