İnsan Derisi Keratinosit İzolasyonu: Deri Örneklerinden Primer Keratinositlerin Kültürlenmesinde Bir Yöntem

Özet

Johansen, C. et al. Yetişkin Derisinden Primer İnsan Keratinositlerinin Üretimi ve Kültürlenmesi. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu videoda, insan derisinin epidermal tabakasının en belirgin hücreleri olan keratinositlerin, enzimatik sindirim ve mekanik bozma yöntemlerinin bir kombinasyonu kullanılarak izolasyonu anlatılmaktadır. Bu yöntem, seçici bir büyüme ortamı kullanarak keratinositlerin diğer cilt hücresi tiplerine göre tercihli büyümesine yardımcı olur.

Protokol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Keratinositlerin İnsan Derisinden İzolasyonu

1. Aşağıdaki çözeltileri yaparak başlayın: DPBS'de 50 mL% 0.25 tripsin ve% 0.1 glikoz çözeltisi. Çözeltiyi karıştırın ve filtreleyin (0.2 μm) sterilize edin. 10 mL RPMI-1640 +% 2 FBS çözeltisi, 50 mL DPBS ve keratinosit serumsuz ortam (KSFM) hazırlayın. 500 mL KSFM'ye KSFM takviyeleri ve 250 μL gentamisin ekleyin. Kullanmadan önce çözeltileri 37 °C'ye ısıtın.
2. Plastik cerrahi geçiren sağlıklı yetişkin gönüllülerden cilt toplayın. Kullanılan deri örnekleri yaklaşık 10 cm x 15 cm'dir ancak boyutları değişebilir. Deri örneklerini bir soğutma elemanı içeren bir Strafor kutu içinde taşıyarak taşıma sırasında cildi serin tutun. Gerekirse, cilt örneği gece boyunca 4 °C'de saklanabilir.
3. Sterilize edilmiş makas, neşter ve forseps kullanarak cilt bölümünün altındaki yağları alın.
4. Cilt bölümünü (yaklaşık 10 cm x 15 cm) iğneler kullanarak bir plakanın üzerindeki steril bir örtü üzerine kemerle bağlayın. İlk olarak, cildi kuru sterilize edilmiş bir gazlı bezle temizleyin. Ardından, %70 etanol içeren sterilize edilmiş bir gazlı bez kullanarak cildi temizleyin.
5. Bir ayak planya makinesi kullanarak, cilt bölümünün üst tabakasını (epidermis) kesin ve 9 cm'lik bir Petri kabına koyun. Ardından, hemen 25 mL DPBS/tripsin/glikoz çözeltisi (adım 1.1'de hazırlanan) Petri kabına ekleyin. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
6. Bir pipet kullanarak, DPBS / tripsin / glikoz çözeltisini Petri kabından çıkarın ve tripsini etkisiz hale getirmek için 10 mL RPMI-1640 +% 2 FBS ekleyin.
7. İki forseps kullanarak, şimdi cilt bölümlerinin hem epidermal hem de dermal bölmesini nazikçe kazıyarak ve çalkalayarak epidermal hücreleri ortama bırakın.
8. Epidermal hücre süspansiyonunu metal bir filtreden (1 mm delik boyutu) süzün ve 50 mL'lik bir tüpte toplayın. Kalan cilt bölümlerini, FBS olmadan 10 mL RPMI-1640 içeren 50 mL'lik bir tüpe ekleyin ve 10 saniye boyunca vorteksleyin. Süspansiyonu metal filtreden geçirerek epidermal hücre süspansiyonunu içeren 50 mL'lik bir tüpe süzün. DPBS'yi toplam 50 mL'lik bir hacme ekleyin.
9. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 450 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
10. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletinin boyutuna bağlı olarak epidermal hücre peletini yaklaşık 10 mL 37 °C KSFM'de yeniden süspanse edin. Mikroskop altında Tripan Mavisi boyama yöntemini kullanarak hücreleri sayın. 10 cm x 15 cm'lik bir cilt bölümünden elde edilen hücre sayısı yaklaşık olarak 50-100 x^{10 6} hücredir. Her 75^cm2'lik kültür şişesine 8 x 10⁶ hücreyi 12 mL 37 °C KSFM ile birlikte aktarın. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için kültür şişelerini hafifçe sallayın.
11. Keratinositleri %100 nem ve %5 CO₂ ile 37 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin. Ortamı 2 gün sonra ve haftada üç kez değiştirin. Kültür% 70-80 birleştiğinde hücreler geçer, bu da keratinositlerin çoğalma hızına bağlı olarak yaklaşık 2 hafta sürer.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
KSFM (Türkçe)	ThermoFisher Bilimsel	17005-034	Hücre kültürü ortamı
KSFM takviyeleri	ThermoFisher Bilimsel	37000-015	KSFM için takviyeler
DPBS (DPBS)	ThermoFisher Bilimsel	14190-144	Kalsiyum ve içermeyen DPBS Magnezyum
DMSO (Türkçe)	Sigma-Aldrich	D8418	Dimetil sülfoksit
Gentamisin	ThermoFisher Bilimsel	15710-049	Hücre kültürü ortamı katkı maddesi
Sterilizasyon filtresi	Sartorius	16534	Gözenek boyutu 0,2 olan şırınga filtresi μm
Tripsin	Sigma-Aldrich	T7409	Hücreleri denemek için kullanılır
glikoz	Sigma-Aldrich	G7528	-
dev/dak-1640 dev/dak	ThermoFisher Bilimsel	61870-010	-
FBS (FBS)	ThermoFisher Bilimsel	16000044	Tripsini etkisiz hale getirmek için kullanılır
Forseps	-	-	Herhangi bir şirketten forseps olabilir kullanılmış
makas	-	-	Herhangi bir şirketten makaslar şunlar olabilir kullanılmış
neşter	Swann Morton ·	0501	Herhangi bir şirketten neşterler şunlar olabilir kullanılmış
% 70 etanol	-	-	-
Gazlı bez pedleri	NOBAMED (HAYIRLI)	875420	Herhangi bir sağlayıcıdan gazlı bez pedleri şunları yapabilir Kullanılabilir
Ayak planya makinesi	Credo Solingen	1510	Herhangi bir sağlayıcıdan ayak planya Kullanılabilir
Petri kapları	TPP (Cesaret Partisi	93100	Herhangi bir sağlayıcıdan petri kapları şunları yapabilir Kullanılabilir
Metal filtre	-	-	Şirket içi 1 mm delik boyutu metal filtre
75 cm2 kültür şişesi	NUNC (Ulusal Kızılderili	156499	-
150 cm2 kültür şişesi	Ttp	90151	-
% 0.05 Tripsin-EDTA çözeltisi	ThermoFisher Bilimsel	25300-062	Hücreleri şu durumlarda tripsize etmek için kullanılır Geçiş

Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi adet )