Melanom Kök Hücre İzolasyonu: Manyetik Aktivasyonlu Hücre Sıralaması Kullanılarak CD133 Pozitif ve Negatif Melanom Hücreleri Elde Etmek İçin Bir Yöntem

1. CD133⁺ ve CD133^- Melanom Hücrelerinin LS Sütunları Kullanılarak Manyetik Hücre Sıralaması

1. PBS'de 2 mM EDTA ve% 5 FCS içeren MACS tamponu hazırlayın. 0,22 μm Steritop-GP Filtre Ünitesi kullanarak tamponu ters çevirerek ve steril filtrat yaparak karıştırın. Kullanmadan önce tamponu 4-8 °C'ye soğutun ve gazını alın.
2. Accutase, PBS ve Quantum 263 ortamını 37 °C'ye kadar önceden ısıtın.
3. % 80 birleşik hücreleri PBS ile yıkayın. Uygun miktarda Akutaz ekleyin ve hücreler kültür yüzeyinden ayrılana kadar inkübe edin. Quantum 263 ortamını kullanarak hücreleri 50 mL'lik bir tüpte toplayın.
4. Hücre sayısını belirleyin ve gerekli hücre sayısını 300 x g ve 4-8 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. (Miltenyi'nin protokolüne göre, LS Sütunu başına maksimum 2x 10⁹ hücre yüklenebilir. Hücre hattına özgü optimal sayılar belirlenmelidir ve önemli ölçüde daha düşük olabilir.) Süpernatanı tamamen aspire edin.
5. 350 μL MACS tamponu ile maksimum 1x^{10 8} hücreyi yeniden süspanse edin (daha yüksek hücre sayıları için, aşağıdaki tüm MACS tamponunu, FcR Bloke Reaktifini, CD133 / 1-Biotini ve anti-Biotin MicroBeads hacimlerini uygun şekilde ölçeklendirin).
6. 100 μL FcR bloke edici reaktif ekleyin.
7. 50 μL CD133 / 1-Biotin ekleyin. Bir girdap kullanarak iyice karıştırın ve 4-8 °C'de 10 dakika inkübe edin.
8. 10 mL MACS tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve 300 x g ve 4-8 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen aspire edin.
9. Yıkama adımını (1.8) tekrarlayın.
10. Hücre peletini 400 μL MACS tamponu ile yeniden süspanse edin.
11. 100 μL anti-Biotin MicroBeads ekleyin. Bir girdap kullanarak iyice karıştırın ve 4-8 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
12. Bu arada, manyetik ayırma için MACS ayırıcıyı hazırlayın. QuadroMACS'i MACS Ayırıcı Çoklu Standa takın. QuadroMACS'in manyetik alanında sütun kanatları ile gerekli sayıda LS sütununu öne yerleştirin. Her LS sütununa bir Ön Ayırma Filtresi (30 μm naylon ağlı) ve her sütunun altına uygun bir toplama tüpü (15 mL veya 50 mL) yerleştirin. Filtreyi ve kolonu 3 mL MACS tamponu ile durulayarak hazırlayın. Akışı atın.
13. 10 mL MACS tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve 300 x g ve 4-8 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen aspire edin.
14. Hücreleri 500 μL MACS tamponu ile yeniden askıya alın ve Ön Ayırma Filtresi ile LS sütununa hücre süspansiyonu uygulayın.
15. Sütun başına 3 mL MACS tamponu ile üç kez yıkayın. Yeni tamponu yalnızca sütun rezervuarı boşken ekleyin.
16. Toplanan toplam atık su, etiketlenmemiş CD133^- hücre fraksiyonunu içerir.
17. Ön Ayırma Filtresini atın, sütunu ayırıcıdan çıkarın ve uygun bir toplama tüpüne yerleştirin.
18. 5 mL MACS tamponu uygulayın. Pistonu kolona sıkıca iterek etiketli CD133⁺ hücrelerini hemen yıkayın.
19. Negatif fraksiyonun saflığını arttırmak için, QuadroMACS'e yerleştirilmiş yeni bir dengelenmiş LS sütununa hücre süspansiyonu uygulayın. Atık su, CD133^- fraksiyonunu içerir.
20. Sütunları atın.