Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Melanosit ve Fibroblast İzolasyonu
- 0 ila 4 günlük erkek ve / veya dişi C57Bl / 6J yavrularını dekapitasyon ile ötenazi yapın ve cerrahi makas kullanarak ötenazi yapılmış farelerden ekstremiteleri çıkarın.
- Laminer akış kabininde, her farenin gövdesini %70 etanol içeren steril bir Petri kabında kısaca yuvarlayın. Gövdeyi etanolden çıkarın ve boş, steril bir Petri kabına koyun.
- % 70 etanol içinde sterilize edilmiş cerrahi makas kullanarak, boyundan kuyruğa kadar gövdenin ventral tarafındaki deride bir kesi yapın. Steril forseps kullanarak cildi farenin gövdesinden soyun.
- Cildi, dermis tarafı aşağı bakacak şekilde 3 mL 1x Antibiyotik / Antimikotik solüsyon içeren 6 oyuklu bir tabağa koyun ve oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin.
- Aşağıdaki ayarlar yerindeyken doku doğrayıcıyı açın: Dilim kalınlığı: 1 μm; Bıçak kuvveti: maksimumun ~%60'ı; Hız: Maksimumun ~%50'si.
- Cildi dermis tarafı aşağı bakacak şekilde steril bir doku doğrayıcı diske aktarın ve cildi tamamen aktif doku kıyıcıdan 3 kez geçirin.
- Homojenize cildi 3 mL Cilt Sindirim Tamponu içeren steril, 15 mL konik bir tüpe aktarın (RPMI 1640'ta %10 fetal sığır serumu, %1 penisilin/streptomisin solüsyonu, %1 L-glutamin, 10 mg/mL kollajenaz tip I, %0.25 domuz tripsin ve 0.02 mg/mL deoksiribonükleaz I içeren 3 mL taze Cilt Sindirim Tamponu hazırlayın). Elde edilen süspansiyonu bir P1000 mikropipet ile 10-15 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
- Konik tüpü kapatın ve numuneyi 37 ° C'lik bir su banyosunda 15 dakika inkübe edin, tüpü her 3-5 dakikada bir ters çevirin.
- Konik tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 750 x g'da sallanan bir kova rotorunda santrifüjleyerek cilt homojenindeki hücreleri peletleyin.
- Bir P1000 mikropipet kullanarak, peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek Cilt Sindirim Tamponunu yavaşça ve tamamen çıkarın.
not: Bu aşamada tüm cildin bir kısmı kurtarılabilir ve hücresel saflığın doğrulanması için bir kontrol olarak kullanılabilir. Bu hücreleri 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin ve daha fazla işlem yapın.
- Bir P1000 mikropipet ile 15-20 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini 1 mL Melanosit Ortamında iyice yeniden süspanse edin. Elde edilen hücre çözeltisini, 1 mL Melanosit Ortamı içeren 6 oyuklu bir kabın kaplanmamış bir kuyucuğuna damla damla ekleyin.
- Kaplanmış cilt homojenatını 37 °C ve %5 CO2'ye ayarlanmış bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Kültürlerin 40 dk.
boyunca kuluçkaya yatmasına izin verin
not: Bu süre zarfında, cilt homojenatındaki bazı fibroblastlar, melanositler ve keratinositler süspansiyon halinde kalırken, kaplanmamış tabağa yapışacaktır.
- Kültür süpernatantı, kaplanmamış tabaktan önceden yıkanmış, kollajen kaplı 6 oyuklu bir kabın bir kuyucuğuna aktarın. G418'i, nihai konsantrasyon 100 ng/mL olacak şekilde ortama ekleyin.
- Şimdi yapışkan fibroblastlar içeren kaplanmamış kabın bir kuyucuğuna 2 mL Fibroblast Media ekleyin.
- Her iki kültürü de 37 ° C ve% 5 CO2'ye ayarlanmış bir doku kültürü inkübatöründe gece boyunca inkübe edin.
- Kaplamadan 16-24 saat sonra ortamı ve her kültürden herhangi bir kalıntıyı ayrı ayrı aspire edin. Her kabı 1 mL steril PBS ile iki kez yıkayın ve ardından melanosit kültürüne 2 mL taze Melanosit Besiyeri artı 100 ng/mL G418 ve fibroblast kültürüne 2 mL taze Fibroblast Besiyeri ekleyin. (% 10 fetal sığır serumu,% 7 at serumu,% 1 penisilin / streptomisin çözeltisi,% 1 L-glutamin, 0.5 mM di-bütiril siklik AMP (dbcAMP), 20 nM tetradekanoilforbol 13-asetat (TPA) ve 200 pM kolera toksini (CT) içeren 6 mL taze Melanosit Ortamı hazırlayın><.
NOT: Konsantre dbcAMP, TPA ve CT stok çözeltileri yapılabilir, alıntılanabilir ve >80 °C'de 1 yıl süreyle saklanabilir. Bu bileşenlere sahip olmayan temel ortamlar 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir.
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unda %10 fetal sığır serumu, %1 penisilin / streptomisin ve %1 L-glutamin içeren 4 mL Fibroblast Media hazırlayın. Bu ortam 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir)
- Melanosit kültürleri 48 saat boyunca G418 ile muamele edildikten sonra, hücreleri 1 mL steril PBS ile iki kez yıkayın ve kültüre G418 içermeyen 2 mL taze Melanosit Ortamı ekleyin.
not: Melanosit kültüründeki fibroblastlar G418 tedavisinden sonra ölmeye devam ettikçe, ölü hücreleri çıkarmak ve taze Melanosit Ortamı eklemek için kabı steril PBS ile yıkayın. Melanosit ve fibroblast kültürleri %70-80 birleşim noktasına ulaştığında geçilmelidir.
