Rekombinant Merkel Hücreli Polyomavirüs (MCPyV) Virion Hazırlığı: Yüksek Titreli Rekombinant MCPyV Virion Üretmek İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Wei Liu et al. Merkel Hücreli Polyomavirüs Enfeksiyonu ve Tespiti, J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, 273TT hücreleri kullanılarak Merkel hücre polyomavirüsü veya MCPyV viryonlarının hazırlanışını gösteriyoruz. Bu teknoloji, rekombinant MCPyV virionlarının yüksek titresinin üretilmesine yardımcı olur.

Protokol

1. Rekombinant MCPyV virion hazırlığı

1. Viral genomu vektör omurgasından ayırmak için 200 μL'lik bir hacimde (37 ° C'de 4 saat) 250 U BamHI-HF ile 50 μg pR17b plazmidini (MCPyV genomu taşıyan) sindirin (Şekil 1).
2. Sindirilen DNA'ya 1200 μL tampon PB (10 μL 3 M NaAc, pH 5.2 ile desteklenmiş) ekleyin ve 2 miniprep spin sütunu (20 μg DNA kapasitesi) üzerinde saflaştırın. Her kolondan sindirilmiş pR17b plazmitini 200 μL TE tamponu (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA) ile elute edin.
3. Ligasyon reaksiyonunu 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde hazırlayın. Adım 1.2'den 400 μL saflaştırılmış plazmit DNA, 8.6 mL 1.05x T4 ligaz tamponu ve 6 μL yüksek konsantrasyonlu T4 ligaz ekleyin. Gece boyunca 16 °C'de inkübe edin.
4. Ligasyona 45 mL tampon PB (10 μL 3 M NaAc, pH 5.2 ile desteklenmiş) ekleyin ve 2 miniprep spin kolonundan yüklemek için bir vakum manifoldu kullanın. Her sütunu 50 μL TE tamponu ile yükseltin. Yaklaşık 30 μg DNA verimi bekleyin.
5. Öğleden sonra / akşam geç saatlerde, 6 x 10⁶ 293TT hücrelerini% 10 fetal buzağı serumu,% 1 esansiyel olmayan amino asitler ve% 1 higromisin B içermeyen% 1 L-glutamin ile desteklenmiş DMEM ortamı içeren 10 cm'lik bir tabağa tohumlayın.
6. Ertesi sabah, hücrelerin yaklaşık% 50 oranında birleştiğinden emin olun. 66 μL transfeksiyon reaktifi (1.1 μL/^cm2), 12 μg yeniden bağlanmış MCPyV izolatı R17b DNA'sını step 1.4, 8.4 μg ST ekspresyon plazmidi pMtB ve 9.6 μg LT ekspresyon plazmidi pADL'den izole ederek transfekt.
7. Kesilen hücreler neredeyse birleştiğinde, ertesi gün, hücreleri tripsinize edin ve genişlemeye devam etmek için 15 cm'lik bir tabağa aktarın.
8. İsteğe bağlı olarak, genişleme üzerine az sayıda 293TT hücresi alın ve transfeksiyon verimliliğini belirlemek için MCPyV LT (CM2B4) ve VP1 (MCV VP1 tavşanı) için IF boyama yapın. Bu aşamada, nükleer LT sinyalleri görülebilir, ancak VP1 ifadesi muhtemelen tespit edilemez
.
9. 15 cm'lik tabak neredeyse birleştiğinde (genellikle ilk transfeksiyondan 5-6 gün sonra), hücreleri 15 cm'lik üç tabağa aktarın. Hücreleri 15 cm'lik tabaklardan neredeyse birleştiklerinde hasat edin ve aşağıdaki virüs toplama protokolünü izleyin.
   not: İsteğe bağlı olarak, adım 1.8'de açıklandığı gibi IF kalite kontrolünü gerçekleştirin. Hücrelerin çoğu bu aşamada hem MCPyV LT hem de VP1 pozitif olmalıdır.
10. Virüsü hasat etmek için hücreleri tripsinize edin, RT'de 5 dakika boyunca 180 x g'da döndürün ve süpernatanı çıkarın. Bir hücre pelet hacmi DPBS-Mg ekleyin (9.5 mM MgCl₂ ve 1x antibiyotik-antimikotik ile DPBS). Daha sonra, 25 mM amonyum sülfat (1 M pH 9 stok çözeltisinden) ve ardından %0.5 Triton X-100 (%10 stok çözeltisinden), %0.1 Benzonaz ve %0.1 ATP'ye Bağımlı DNaz ekleyin. İyice karıştırın ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
11. Karışımı buz üzerinde 15 dakika inkübe edin ve ardından 0.17 hacim 5M NaCl ekleyin. Karıştırın ve 15 dakika daha buz üzerinde inkübe edin. 4 °C santrifüjde 12.000 x g'da 10 dakika döndürün. Süpernatan net değilse, tüpü yavaşça ters çevirin ve eğirme adımını tekrarlayın. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.
12. 0.8 M NaCl ile desteklenmiş bir hacim DPBS kullanarak peleti yeniden süspanse edin ve adım 1.11'de açıklandığı gibi tekrar döndürün.
13. Adım 1.11 ve 1.12'deki süpernatanları birleştirin ve adım 1.11'de açıklandığı gibi bir kez daha döndürün.
14. Uzun bir iğne veya p1000 pipet ile donatılmış 3 mL'lik bir şırınga kullanarak (% 27, sonra% 33, sonra% 39) ~ 0.7 mL'lik adımlarla ince duvarlı 5 mL poliallomer tüplere iyodiksanol gradyanlarını dökün.
15. Hazırlanan iyodiksanol gradyanı üzerine 3 mL arıtılmış virüs içeren süpernatan yükleyin.
16. Bir SW55ti rotorda 234.000 x g ve 16 °C'de 3,5 saat döndürün. Hızlanma ve yavaşlamayı yavaş olarak ayarlayın.
17. Ultrasantrifüjlemeden sonra, silikonlu tüplerde 12 fraksiyon toplayın (her fraksiyon ~ 400 μL'dir).
18. VP1 (MCV VP1 tavşanı) için dsDNA reaktifi ve/veya Western blot ile virüs varlığı için fraksiyonları analiz edin. Gradyan fraksiyonlarını pik dsDNA ve/veya VP1 içeriği ile birleştirin ve viral genom eşdeğerini hesaplamak için stoğu kantitatif PCR ile karakterize edin. MCPyV virüs stoğunu -80 °C'de saklayın.

Sonuçlar

Şekil 1. Rekombinant viral genom kullanılarak MCPyV virion üretimi.(A) pR17b'nin (MCPyV genom plazmidi) bir plazmit haritası. (B) Bir gradyan üzerinde hasat edilen ve saflaştırılan bir MCPyV virion örneğinin temsili bir resmi. Ok, gradyanın çekirdeğinde yoğunlaşan MCPyV virion bandını işaretler. (C) Her bir gradyan fraksiyonundaki viral genom kopya sa...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM/F12 orta	Thermo Fisher Bilimsel	11330-032
Rekombinant İnsan EGF Proteini, CF	Ar-Ge sistemleri	236-EG-200	-80 santigrat derecede saklayın
CHIR99021	Cayman Kimya	13122	-80 santigrat derecede saklayın
CHIR99021	Sigma	SML1046	-80 santigrat derecede saklayın
Kollajenaz tip IV	Thermo Fisher Bilimsel	17104019
Dispas II	Roche	4942078001
Antibiyotik-Antimikotik	Thermo Fisher Bilimsel	15240-062	Işıktan koruyun
DMEM ortamı	Thermo Fisher Bilimsel	11965084
Paraformaldehit	Sigma	P6148 Serisi
Anti-MCPyV LT (CM2B4)	Santa Cruz Plajı	SC-136172	Çok # B2717
MCV VP1 tavşan		Tavşan poliklonal serum # 10965	https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm