Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Şeffaf Fare Cilt Dokusunun Hazırlanması
>NOT: Bu çalışmada kullanılan tüm fareler C57BL/6 genetik arka planına sahipti
- Fare cilt dokusunun toplanması.
- Fareleri servikal çıkık ile insancıl bir şekilde ötenazi yapın.
- Cildi yaralamamaya özen göstererek bir düzeltici ile ilgili cilt bölgesindeki tüyleri dikkatlice alın.
- Fosfat Tamponlu Tuzlu Serum (PBS) içinde% 70 etanol ile dekontamine etmek için cildi yıkayın.
- Sırt boyun derisini forseps ile kaldırın ve makasla bir kesi yapın.
- Dorsal fare derisinin geniş bir alanını (yaklaşık 1,5 x 4 cm) inceleyin.
- Cildi dermis tarafı aşağı bakacak şekilde bir filtre kağıdı üzerinde düzleştirin ve numunenin ön-arka yönünü not edin.
- Filtre kağıdını diseke edilmiş cildin etrafına kesin ve PBS'de taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi ile doldurulmuş 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
- Oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca buzdolabında 4 °C'de sabitleyin.
- Cildi 15 mL'lik bir tüpte PBS'de 2x5 dakika yıkayın.
not: Aşağıdakiler (1.1.10 - 1.1.12) dokunun uzun süreli depolanması için isteğe bağlı adımlardır.
- Oda sıcaklığında 1 saatlik yıkama adımları sırasında 15 mL'lik bir tüpte artan etanol konsantrasyonu (%25, %50, %70) ile PBS'de disseke edilmiş cildi dehidrat edin.
- Susuz kalmış cildi PBS'de% 70 etanol içinde 15 mL'lik bir tüpte 4 ° C'de daha fazla kullanana kadar saklayın.
- Temizlemeden dört saat önce, oda sıcaklığında 1 saatlik yıkama adımları sırasında 15 mL'lik bir tüpte azalan etanol konsantrasyonu (%70, %50, %25, %0) ile PBS'de cilt dokusunu yeniden sulandırın.
- Fare derisi biyopsilerinin temizlenmesi
- 3.85 g üre ve 3.85 g N, N, N', N'-tetrakis (2-hidroksipropil) etilendiamini 60-70 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtıcıda 5.38 mL damıtılmış su içinde çözerek CUBIC1 temizleme çözeltisini hazırlayın. Sıcak bir karıştırıcı kullanın.
- Berraklaştığında ve oda sıcaklığına soğuduğunda çözeltiye 2.31 g polietilen glikol mono-p-izooktilfenil eter / Triton X-100 ekleyin.
- Fare derisini keskin bir tıraş bıçağıyla yaklaşık 0,2 x 0,5 cm boyutlarında biyopsiler halinde kesin ve 15 mL'lik bir tüpe 5 mL CUBIC1 temizleme solüsyonuna batırın. Saç foliküllerinin görselleştirilmesini optimize etmek için, biyopsinin uzun tarafının numunenin ön-arka yönü boyunca kesildiğinden emin olun.
- 37 °C'de bir hibridizasyon fırınında dönen bir platform üzerine yerleştirin.
- Temizleme solüsyonunu 7 gün sonra değiştirin. Kullanmadan önce taze bir CUBIC1 solüsyonu hazırlayın.
- 7 gün sonra dokunun şeffaflığını kontrol edin. Gerekirse, doku tamamen şeffaf olana kadar biyopsileri CUBIC1 temizleme solüsyonunda bırakın.
- Deri biyopsisi şeffaf hale geldikten sonra, CUBIC1 solüsyonunu çıkarın ve dokuyu 37 ° C'de 6 saat boyunca 4 kez yıkamak için 4 mL 1x PBS ekleyin.
- Cilt dokusunu PBS'de% 20 w / v sükroz halinde 15 ml'lik bir tüpte 37 ° C'de 4 saat boyunca yıkayın.
- Dokuyu montaj ortamında dondurun Optimum Kesme Sıcaklığı (OCT) Bileşiği 15 mL'lik bir tüpte gece boyunca -80 °C dondurucuda.
not: Bu adım, sonraki adımlarda antikor penetrasyonu için biyopsinin geçirgenliğini artıracaktır.
2. İmmünofloresan Boyama
- Dokuyu (adım 1.2.9) 2-3 saat oda sıcaklığına kadar çözdürün.
- OCT Bileşiğini çıkarmak için dokuyu 15 mL tüpte 5 mL PBS ile oda sıcaklığında 8 saat boyunca yıkayın.
- Biyopsileri 2 mL'lik bir tüpe aktarın ve dokuyu 1 mL tavşan anti-Keratin14 veya tavşan anti-Ki67 antikoru içinde inkübe edin, her ikisi de PBST'de (PBS +% 0.1 Triton-X100) 1:100 oranında seyreltilir 37 ° C'lik bir fırında bir çalkalayıcı üzerinde 3 gün boyunca.
- Biyopsileri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve dokuyu 37 ° C'lik bir fırında bir çalkalayıcı üzerinde 5 mL PBST'de 6 saat boyunca 4 kez yıkayın.
- Biyopsileri 2 mL'lik bir tüpe aktarın, PBST'de 1:100 oranında seyreltilmiş 1 mL anti-tavşan Alexa594 ikincil antikoru ekleyin ve 37 °C'lik bir fırında bir çalkalayıcı üzerinde 3 gün inkübe edin.
- Biyopsileri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve dokuyu 37 ° C'lik bir fırında bir çalkalayıcı üzerinde 5 mL PBST'de 6 saat boyunca 4 kez yıkayın.
- Biyopsileri 2 mL'lik bir tüpe aktarın, PBST'de 1 mL 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) nükleer karşı boyama çözeltisi (1: 1.000) ekleyin ve 37 ° C'lik bir fırında bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca inkübe edin.
- DAPI karşı boyama solüsyonunu çıkarın ve dokuyu 37 ° C'lik bir fırında bir çalkalayıcı üzerinde 6 saat boyunca 4 kez yıkamak için 2 mL tüpe 1 mL PBST ekleyin.
not: İsteğe bağlı adım: Biyopsiler karanlıkta en az 3 hafta boyunca% 0.02 sodyum azid içeren 1x PBS'de saklanabilir.
3. Görüntüleme
- %50 (a/h) sakaroz, %25 (a/h) üre, %10 (a/h) 2,2",2'-nitrilotrioetanol ve %0.1 (h/h) Triton X-100 içeren CUBIC2 temizleme solüsyonunu hazırlayın.
- Cilt dokusunu 1 mL CUBIC2 çözeltisi içinde 2 mL'lik bir tüpte 37 ° C'lik bir fırında 24 saat boyunca bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Bu adım, dokunun kırılma indisini eşitleyecektir.
- Dokunun netliğini kontrol edin. Temizlendikten sonra, tüm cilt biyopsisini (0,2 x 0,5 cm) uzun tarafına, saç foliküllerinin uzunluk yönü lamel yüzeyine paralel olacak şekilde (#1 24 x 60 mm) bir cam lamel üzerine yerleştirin.
not: İsteğe bağlı adım: Antikor lekeli biyopsiler CUBIC2 solüsyonunda yaklaşık 7 gün saklanabilir. Nil Kırmızısı lekeli biyopsiler CUBIC2 solüsyonunda sadece 1 güne kadar saklanabilir ve mümkün olan en kısa sürede görüntülenmelidir.
- Görüntüleme odasını hazırlayın (Şekil 1).
NOT: Görüntüleme odasının hazırlanması için gerekli sarf malzemeleri şunlardır: mavi yapışkan, oyun hamuru veya benzeri ve 2 lamel (24 x 50 mm) (Şekil 1A).
- İki ince mavi raptiye şeridi (çap yaklaşık 1 mm x 2 cm) ve iki lamel hazırlayın (Şekil 1B).
- Cilt biyopsisi için yeterli alan sağlayacak şekilde mavi yapışkan şeritleri bir kapak fişine yerleştirin (Şekil 1C, adım 3.4.3).
- Deri biyopsisini lamel üzerindeki şeritlerin arasına bir damla CUBIC2 solüsyonu içinde yerleştirin (Şekil 1C).
- Deri biyopsisini ikinci lamel ile örtün (Şekil 1D).
- Monte edilmiş deri biyopsisi ile görüntüleme odasını konfokal mikroskop aşamasına yerleştirin ve dokuyu ışık yoluna taşıyın.
- İlgilenilen floresan lekeli bölgeleri belirlemek için bir cıva veya halojen ışık kaynağı ve standart epifloresan filtreleri (örn. DAPI/GFP/CY3/CY5) kullanarak numuneyi tarayın.
- 10X ve 20X objektif (NA 0.75) ve standart konfokal floresan görüntüleme teknikleri kullanılarak ilgilenilen bölgelerin görüntülenmesi (örneğin, DAPI ile boyanmış numuneler 405 nm lazerle aydınlatılır ve 425-475 nm arasında floresan sinyali toplar ve Alexa Fluor 594 veya Nil Kırmızısı ile boyanmış numuneler 561 nm lazerle aydınlatılır ve 570-620 nm arasında floresan sinyali toplar).
- Mikroskop Z-yığını görüntü elde etme yazılımını kullanarak (örneğin, aşağıda açıklandığı gibi NIS öğeleri görüntüleme yazılımı 4.13'ü kullanarak) ilgilenilen her bölgenin görüntü Z-yığınlarını oluşturun.
- Optimum lazer gücünden emin olun ve örnek floresansını toplamak için PMT HV/Ofset ayarlarını seçin.
- "Edinme Kontrolleri"nden "ND Alımı" araç çubuğunu açın.
- "Z serisi Kurulum" sekmesini seçin (diğer tüm sekmelerin seçili olmadığından emin olun).
- Canlı tarama sırasında, örneğin üst kısmına odaklanın ve "Üst" düğmesine basın.
- Numunenin alt kısmına odaklanın ve "Alt" düğmesine basın.
- Gerekli adım boyutunu girin (veya optimize edilmiş adım boyutu düğmesine basın).
- "Şimdi Çalıştır" düğmesine basın.
- Elde edilen Z yığınlarını ayrı Tiff görüntü yığınları olarak kaydedin (görüntü Z yığını başına 1 florokrom).
- 3B analiz yazılımını kullanarak ilgilenilen 3B hacim bölgelerini yeniden oluşturmak için görüntü Z-yığınlarını kullanın (örneğin, aşağıda açıklandığı gibi Imaris x64 7.2.3 kullanarak).
- Analiz yazılımını başlatın.
- 3D hacim oluşturma için araç çubuğundaki "Aş" düğmesini seçin.
- İlk renkli görüntü Z yığınını açın (örneğin, DAPI).
- Florokrom başına bir kanal olmak üzere ek renk kanalları eklemek için 'kanal ekle' aracını kullanın. Bu nedenle, hem DAPI hem de Alexa Fluor 594 florokromları içeren bir numune iki kanal gerektirecektir.
- Yukarıdaki 3.7'de belirtildiği gibi doğru piksel (voksel) boyutlarını (XYZ) ayarlamak için "Görüntü Özellikleri" aracını kullanın.
- Kanal renklerini gerektiği gibi değiştirmek için "Ekran Ayarı" aracını kullanın (örneğin, DAPI kanalını maviye, Alexa Fluor 594 kanalını kırmızıya ayarlayın).
- 3B cildi görüntü penceresine yerleştirmek için, bilgisayar faresini kullanarak ses seviyesini gerektiği gibi tıklatın ve sürükleyin.
- 3D görüntünün ekran görüntülerini oluşturmak için araç çubuğundaki "Anlık Görüntü" aracını kullanın.
- 3D örnek döndürme filmleri oluşturmak için araç çubuğundaki "Animasyon" aracını kullanın.
