$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Primer İnsan Keratinositlerinin Genetik Olarak Değiştirilmesi
>NOT: Primer insan keratinositlerini enfekte etmek için virüsler üretmek için tam DMEM ortamında [DMEM + %10 fetal sığır serumu (FBS) + kalem/strep] büyütülen amfotropik anka kuşu hücrelerini kullanın. Gag-pol ve zarf gibi proteinleri kodlayan viral paketleme genleri, retroviral bir vektör ile transfekte edildiğinde virüs üretimine izin veren anka kuşu hücre genomuna kararlı bir şekilde entegre edilir. Phoenix hücreleri, yüksek viral titre üretimine izin veren yüksek verimlilikle transfekte edilebilir. Bu paketleme hattından üretilen virüsler, insanlar da dahil olmak üzere çok çeşitli memeli hücrelerini de enfekte edebilir.
- 1. Gün: Transfeksiyondan bir gün önce, anka kuşu hücrelerini tam DMEM ortamında oyuk başına 800.000 hücre yoğunluğunda 6 oyuklu bir plakada tohumlayın.
- 2. Gün: Transfeksiyon günü, oyuk başına 3 μg retroviral vektör kullanın. 3 μg retroviral vektörü 1.5 mL'lik bir tüpe alın. Her 3 μg vektör için 100 μL DMEM artı 6 μL transfeksiyon reaktifi karışımı kullanın. 1.5 mL'lik bir tüpte 6 μL transfeksiyon reaktifini 100 μL DMEM ile karıştırın. (Kullanılan retroviral vektörler ekipman/malzeme tablosunda listelenmiştir)
- 5 dakika inkübe edin ve 106 μL karışımı, 3 μg retroviral vektör içeren önceden kesilmiş tüpe ekleyin. Karıştırın ve RT'de 30 dakika inkübe edin. Bu karışımın tamamını anka kuşu hücrelerinin her bir kuyucuğuna damla damla ekleyin.
- 3. Gün: Transfeksiyondan sonraki gün, ortamı anka kuşu hücrelerinden çıkarın ve 2 mL taze tam DMEM ortamı ekleyin. Aynı gün, birincil insan keratinositlerini kuyu başına 75.000 hücre yoğunluğunda 6 oyuklu plakalara tohumlayın. Keratinositleri antibiyotikli (pen/strep) keratinosit serumsuz bir ortamda (KCSFM) muhafaza edin.
not: Primer insan keratinositleri satın alındı. Hücreler çeşitli satıcılardan satın alınabilir (Malzemeler tablosunda listelenmiştir).
- 4. Gün: Ortamı, şimdi viral parçacıklar içeren transfekte edilmiş anka kuşu hücrelerinden hasat edin. Ortamı bir şırınga kullanarak (kirletici anka kuşu hücrelerini çıkarmak için) 0.45 μm'lik bir filtreden geçirin ve keratinositlerin üzerine 2 mL yerleştirin (önceki gün 75.000 hücre / kuyucukta kaplanmıştır). Enfeksiyon sürecine aracılık etmeye yardımcı olmak için ortama heksadimetrin bromür (5 μg/mL) ekleyin. Viral titreler ~ 1 x 107 TU / mL'dir.
- 6 oyuklu plakaları RT'de 1 saat boyunca 200 x g'da bir santrifüjde döndürün. Döndürme işleminden sonra, virüs içeren ortamı çıkarın ve KCSFM eklemeden önce hücreleri 1x PBS ile bir kez yıkayın.
- 5. Gün: Heksadimetrin bromür (5 μg / mL) içeren 2 mL filtrelenmiş ortam kullanarak, 1.4'teki gibi aynı keratinosit grubunu tekrar enfekte edin. Virüs içeren ortamı çıkarmak için RT'de 1 saat boyunca 200 x g'da döndürün ve 1x PBS ile yıkayın, ardından KCSFM.
ekleyin
not: Retroviral vektör üzerinde seçilebilir bir belirteç varsa, bir ilaç kullanarak keratinositleri seçin ve aşağı akış analizinde veya organotipik kültürler gibi uygulamalarda kullanım için genişletin.