Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Primer Keratinosit Hasadı ve Tohumlama
- Onaylı hayvan tesisi / IACUC standartlarına göre CO2 soluma yoluyla dört ila beş yetişkin dişi fareye ötenazi yapın. Bununla birlikte, bu protokol tek dişi / erkek fareler için de kullanılabilir.
- Sırt kürkünün yaklaşık 9cm2'sini elektrikli bir hayvan kesme makinesi ile kırpın ve kırpılan tüm fareleri, 1-2 dakika boyunca üzerlerini örtecek kadar povidon-iyot antiseptik solüsyonu (ovma değil) içeren 500 mL'lik bir kavanoza koyun. Antiseptik solüsyonu farelerin üzerine eşit şekilde kaplamak için kavanozu iyice çalkalayın.
- Solüsyonu dökün ve sıvı berraklaşana kadar temiz suyla durulayın. Aynı antiseptik yıkamayı tekrarlayın ve ardından suyla durulayın. İyot çözeltisi ile antiseptik yıkamadan sonra, tüm fareleri 5-10 dakika% 70 etanol içinde 5-10 dakika < br / >
NOT: Açık kürklü fareler (ör., BALB/c) antiseptik iyot yıkamalarından hafif sarımsı bir rengi korurken, daha koyu fareler (ör., C57BL/6) tutmaz. Özellikle, sarı renk nedeniyle hücre canlılığı veya kültür büyümesi etkilenmez.
- Kırpılmış sırt derisini, laminer akış başlığında başparmak forseps ve makas kullanarak dikkatlice çıkarın. Eksize edilen sırt deriyi PBS / 2x gentamisin ile doldurulmuş konik bir tüpe yerleştirin. Kültürde meme hücresi kontaminasyonunu önlemek için ventral yan deri kullanmaktan kaçının.
- Otoklavlanmış forseps ve bir neşter kullanarak, ince bir Petri kabına tüylü tarafı aşağı bakacak şekilde bir sırt derisi yerleştirin. Cilt dokusunun ventral tarafındaki yağ da dahil olmak üzere tüm deri altı dokusunu yarı saydam olana kadar kazımaya başlayın. Cildi yırtmadan (saç folikülü kısmı) maksimum deri altı dokusu izlerini çıkarmaya çalışın. Ayrıca, uzun süre kazımayın ve cildin kurumasını önleyin.
- Kalan tüm diğer deriler işlenene kadar kazınmış cildi PBS solüsyonunda tutun. Daha sonra bir neşter kullanarak derileri 0,5 cm x 1-1,5 cm'lik şeritler halinde dilimleyin ve tüylü tarafı yukarı bakacak şekilde steril bir Petri kabına yerleştirin.
- Tripsin (% 0.25) ile karıştırılmış 20 mL PBS / 2x Gentamisin solüsyonunu 100 mm x 20 mm'lik plastik bir Petri kabına dikkatlice pipetleyin. Steril forseps kullanarak, derileri aktarın ve 32 ° C'lik bir inkübatörde 2 saat boyunca tripsin çözeltisinin yüzeyinde tüylü tarafı yukarı bakacak şekilde yüzdürün.
NOT: Tripsinizasyon süresi ve sıcaklığı, yüksek oranda kültürlenebilir birincil keratinositlerin iyi bir verimi için çok önemlidir. Diğer yöntemler canlı hücrelerin iyi verimini sağlayabilse de, keratinositlerin kültürlenebilirliği daha az tatmin edici olmuştur.
- Bu 2 saatlik inkübasyon süresi boyunca, bulaşıkları kollajen kaplama ile kaplayın ve 1 saat boyunca 37 °C'ye yerleştirin (bkz. adım 1.1.2). Klonojenik tahliller için, 60 mm'lik Petri kapları, ışınlanmış 3T3 besleyici tabakasının tabana yapışmasını ve eşit şekilde yayılmasını sağlamak için keratinosit hasadından 24 saat önce kaplanır.
not: Klonojenik kültür için kültür kaplarının kaplanması, farelerin epidermal keratinositlerinin uygun bağlanması, koloni oluşumu ve nihai büyümesi / çoğalması için çok önemlidir.
- Epidermal kazıma adımı: Steril bir plastik kare Petri kabı düzenleyin ve 15 mL hasat ortamı ile uygun epidermal kazıma için 30 ° eğimde bir yüzey oluşturun (bkz. Tablo 1). Yüzen bir cilt şeridini kavisli forseps ile tripsin çözeltisinden dikkatlice çıkarın. Ardından, yeni bir neşter bıçağı ile epidermisi ve kılları ortama kazıyın.
- Aşırı kuvvet kullanmayın, ancak epidermisi kazımak veya hücre canlılığını etkilemek için yeterli kuvvet kullanın.
- Epidermis kazıma sırasında, bıçağı cilt parçasına dik tutun. Bıçak, bıçağın hareketine doğru açılıysa, derinin yırtılma olasılığı daha yüksektir. Bıçak, bıçak hareketinden uzağa açılı ise, epidermisin eksik çıkarılması olasılığı daha yüksektir.
- Kazınmış epidermal hücreler içeren hasat ortamını, 1,5 inçlik bir manyetik karıştırma çubuğu ile steril bir 60 mL kavanoza (otoklavlanabilir ve tekrar kullanılabilir) dikkatlice dökün. Kalan epidermal hücreleri toplamak ve son hacmi 30 mL'ye getirmek için Petri kabını ek bir hasat ortamı ile durulayın. Manyetik bir karıştırıcı kullanın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 100 rpm'de karıştırın. Bu işlem, sıkışmış epidermal hücreleri kıllardan çıkaracaktır.
- 50 mL'lik konik bir tüpün üstüne 70 μm'lik steril bir hücre süzgeci yerleştirin. Hücre süzgeci, 50 mL'lik konik bir tüpün üzerine sığar.
- Kavanozu bir biyogüvenlik başlığının içine alın. Karıştırma çubuğunu çıkarın ve içindekileri 50 mL'lik konik bir tüpe bağlı süzgeç filtreye dökün. İstenmeyen saçları ve stratum corneum tabakalarını süzün.
- Kılları süzgeç içindeki stratum corneum materyalleriyle birlikte bastırın ve sıkışan saç hücrelerini serbest bırakmak için onları manipüle edin. Kalan sıkışmış hücrelerin serbest kalmasına ve tüpe akmasına izin vermek için 5 mL hasat ortamı kullanın. Konik bir tüpte toplam hacmi 50 mL'ye getirin.
- 50 mL konik tüpü hücre süzüntüsü ile kapatın ve 4 ° C'de 7 dakika boyunca 160 x g'da santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı aspire edin ve 5 mL hasat ortamı ekleyin. Son olarak, 5 mL'lik bir pipet ile hafifçe ~ 20x ezerek hücre peletini yeniden süspanse edin.
- Bu adımda, herhangi bir toplanmayı önlemek için hücreleri bir buzlukta tutun. Daha sonra, 25 mL hasat ortamı ekleyin ve tekrar ezin (20-25x).
- Bu adımda doğru bir keratinosit sayımı sağlamak için 1 mL hücre süspansiyonu alın ve 19 mL hasat ortamı ekleyin. Şimdi, hücre seyreltmesi 50 mL'lik konik bir tüpte 1:20'dir. Keratinositler tek bir fareden toplanırsa, hücre süspansiyonunun hacmini ayarlayın. Örneğin, 30 mL yerine 15 mL kullanın ve hücreleri saymak için 1:10 seyreltme yapın.
- 50 mL konik tüpten (1:20 seyreltme) 0,5 mL seyreltilmiş hücreleri pipetleyin ve 1,5 mL'lik otoklavlanmış bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 0.2 mL (200 μL) hücre karışımını başka bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne çıkarın ve eşit hacimde (200 μL)% 0.4 Tripan mavisi çözeltisi ekleyin. Bu çözeltiyi 3x yavaşça karıştırın ve çekirdekli keratinositleri saymak için hücreleri bir hemositometreye aktarın.
- Tripan mavisi için pozitif olan tüm koyu mavi hücreleri canlı olmayan ölü hücreler olarak puanlayın ve küçük altın ve pembemsi hücreleri canlı hücreler olarak puanlayın. Bu nedenle, fare başına nihai keratinosit verimi yaklaşık 30 milyon canlı hücre olmalıdır.
- Orijinal 50 mL konik tüpü (adım 1.8'den itibaren) 4 ° C'de 160 x g'da 7 dakika santrifüjleyin. Bu adımda, hücreleri istenen ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri tohumlamak için gerekli seyreltmeyi yapın.
- Kitle kültürü için, hücre kültürü ortamında (KGM tipi ortam + tek katmanlı kültürler için takviyeler) her 35 mm'lik Petri kabına 2 ila 4 milyon canlı altın hücre tohumlayın (bakınız Tablo 1). Klonojenik (koloni oluşumu) bir test için, X-ışını ile ışınlanmış İsviçre faresi 3T3 besleyici katmanları ve takviyeler ve serum ile modifiye edilmiş Willia's E ortamı üzerinde 60 mm Petri kabı başına 1.000 hücre tohumlayın.
- Sırasıyla 35 mm ve 60 mm Petri kapları için toplam 2 ila 4 mL orta kullanın. Ayrıca,% 5 CO2'de kullanılmak üzere azaltılmış sodyum bikarbonat seviyeleri ile ATCC'den temin edilen DMEM ve Williams E ortamını formüle edin.
- Kültür hücrelerini (kütle veya klonojenik) 32 °C'de,% 95 nemde% 5 CO 2 ile büyütün. Medyayı, kitle kültürü için ilk tohumlamadan bir gün sonra ve daha sonra haftada 3 kez değiştirin. Bununla birlikte, klonal tahliller için, ilk ortam değişikliği hücre tohumlamasından 2 gün sonra ve daha sonra haftada 3 kezdir.
- Klonal kültür için, hücreleri iki ve dört haftalık aralıklarla yetiştirin. Klonal kültürlerin tamamlanmasından sonra (2 veya 4 hafta), ortamı aspire edin. Kolonileri gece boyunca oda sıcaklığında% 10 tamponlu formalin içinde sabitleyin ve% 0.5 rodamin B ile otoklav suyunda 1 saat boyayın. Daha sonra rodamin B lekesini bulaşıkların kenarından bir pipet yardımıyla çıkarın.
- Bulaşıkları soğuk otoklavlı suda, bulaşıklar berraklaşana kadar durulayın. Bulaşıkları bulaşıkların kapağına eğimli olarak koyun ve son koloni sayımı için kurumaya bırakın. Özellikle, klonojenik kültür testi yaparken, asla <1 mL hücreyi pipetlemeyin. Hücreler konsantre ise, hücre konsantrasyonunu seri olarak seyreltin.
| Çözümler ve Medya | Yorum |
| Hasat Çözümleri | |
| % 2.5 tripsin (5 mL) | |
| Dulbecco'nun PBS'si (500 mL) | |
| Gentamisin (2 mL) | |
| 2x gentamisin içeren PBS (45 mL) | |
| 2x gentamisin içeren fosfat tamponlu salin (PBS) | |
| Tripsin çözeltisi | |
| Hücre Kültürü Çözümleri | |
| Purecol-fibronektin bulaşık kaplama çözeltisi: | |
| 1 M HEPES (1 mL) | |
| 116 mM CaCl2 (1 mL) | |
| Sığır serum albümini 1.0 mg / mL (10 mL) | |
| Hücre kültürü ortamı (100 mL) | |
| Fibronektin (1 mg) | |
| Purecol kollajen (1 mL) | |
| Hücre dondurma çözeltisi | |
| DMSO (2 mL) | |
| %10 BCS ve pen-strep ile DMEM | |
| Hasat Ortamı | Kalsiyumsuz olması gerekiyor |
| 2x gentamisin (1 mL) | |
| FBS (50 mL) | |
| KOBİ (500 mL) | |
| Yüksek Kalsiyumlu Williams'ın E Media'sı: | |
| EGF (5 μg/mL) 1 mL | |
| Glutamin 14.5 mL | |
| Hidrokortizon (1 mg / mL) 0.5 mL | |
| İnsülin 1 mL | |
| LinoAsit-BSA (0.1 mg / mL) 0.5 mL | |
| MEM Ess AminoAsitler 4 mL | |
| MEM Vitaminleri 5 mL | |
| Penisilin-Streptomisin 5 mL | |
| Transferrin (5mg / mL) 1 mL | |
| Vit A (1 mg / 1.000 μL) 57,5 μL | |
| Vit E 1 mg / mL (4 ° C) 3.5 μL | |
| Vit D2 (10 mg / mL) 50 μL | |
| 3T3 fibroblast tam büyüme ortamı (CGM) | |
| BCS (100 mL) | |
| DMEM (900 mL) | |
| Penisilin-streptomisin (10 mL) | |
| KGM (Tarım Hizmetleri) | Kitle kültürü için kullanılan ortam, indirgenmiş bir kalsiyum ortamıdır |
| Morris 2 medium, Williams'ın E'si ile aynı takviyelere sahip | Takviyelerle Williams E'nin azaltılmış kalsiyum çeşidi |
Tablo 1: Çözüm ve ortam tarifleri.
