miniCoopR Vektör Tabanlı Transgenez: Zebra Balığı Tümör Modelinde Melanoma Neden Olan Genleri Taramak İçin Bir Teknik

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Melanom Başlangıç Değiştiricileri için Tarama

1. PCR ile Ağ Geçidi orta giriş klonları oluşturun, ilgilenilen genlerin (GOI) tam uzunlukta açık okuma çerçevesini yükseltin ve BP klonaz II (Invitrogen) kullanarak pDONR 221'e yeniden birleştirin. MiniCoopR vektöründe mitfa promotörü altına ilgilenilen genleri yerleştirmek için p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA ve miniCoopR'yi yeniden birleştirmek için Multisite Gateway teknolojisini (Invitrogen) kullanın (Şekil 1A).
2. Her klonun 25 pikogramını 25 pikogram Tol2 transpozaz mRNA'sı ile birlikte tek hücreli Tg(mitfa:BRAFV600E) enjekte edin; P53(LF); Mitfa(LF)Daha önce tarif edildiği gibi üçlü homozigot zebra balığı embriyoları. Enjekte edilen embriyoları 28.5 ° C'de inkübe edin. Ölü embriyoları 24 hpf'de çıkarın.
3. Enjekte edilen embriyoları içeren Petri kabını beyaz bir arka plana karşı gelen ışık altında bir diseksiyon mikroskobuna yerleştirerek 72 hpf'de kurtarılan melanositlere sahip transgenik hayvanları seçin (Şekil 1A).
4. Hayvanları zebra balığı tesisinin fidanlığındaki 3 L'lik tanklara 4 dpf'de aktarın.
5. 2 ayda, en az bir melanosit kurtarma alanı 4^mm2'den büyük olan hayvanları seçin (Şekil 1A). 72 hpf'de melanosit kurtarma derecesi ile 2 aylıkta melanosit kurtarma derecesi arasında güçlü bir ilişki vardır. Melanosit kurtarmalı embriyolar 72 hpf'de toplandığında, çoğunluğu (~% 80) 2 ayda 4^mm2'den daha büyük en az bir melanosit kurtarma alanına sahip olacaktır.
6. Seçilen hayvanları tümör varlığı açısından haftalık olarak tarayın (Şekil 1B). Histopatolojik ve morfolojik değişiklikler arasında güçlü bir korelasyon vardır. İyi huylu durumdan kötü huylu duruma geçiş, lezyonlar hayvanın yüzeyinden yükseldiğinde morfolojik bir değişiklik olarak kabul edilir. Çalışma için tümör taşıyan hayvanları izole edin.
7. Apsiste haftalar içinde yaşla birlikte melanomsuz sağkalım eğrileri ve ordinatta melanomsuz sağkalım yüzdesi çizin. İlgilenilen bir geni eksprese eden melanositli hayvanlar, melanositlerde EGFP (gelişmiş yeşil floresan proteini) eksprese eden kontrol hayvanları ile karşılaştırılır (Şekil 1C). MiniCoopR-EGFP enjekte edilen hayvanlar için medyan tümör başlangıcı yaklaşık 18 haftadır. Bir günlük sıralama testi kullanarak iki eğrinin istatistiksel olarak farklı olup olmadığını belirleyin.

Şekil 1. MiniCoopR testi kullanılarak melanom başlangıç değiştiricileri için tarama. A) MiniCoopR testinin şeması. MiniCoopR vektörünü ve ilgilenilen geni içeren kurtarılmış melanositlere (ok ucu) sahip embriyo. Ölçek çubuğu = 250 μM.4 mm'den büyük 2 melanosit kurtarmaya (ok ucu) sahip yetişkin. Ölçek çubuğu = 500 μM B) MiniCoopR-EGFP, amelanotik ve pigmentli bir tümör (ok uçları) olan zebra balığını kurtardı. C) Onkogen SETDB1 ve bir kontrol EGFP genini eksprese eden tümörleri karşılaştıran temsili melanomsuz sağkalım eğrisi (p = 9.4×10-7, log-rank χ2).