Ölçek Melanositlerinin Antikor Boyama: Zebra Balığı Modellerinin Dorsal Ölçekle İlişkili Melanositlerinde İfade Edilen Transkripsiyon Faktörlerini Tespit Etme Tekniği

Özet

Kaynak: Sharanya Iyengar et al. Zebra Balığı Otokton Tümör Modeli Kullanılarak Melanom Değiştiricileri için Tarama. J. Vis. Uzm. (2012)

Bu videoda, zebra balığı modellerinin dorsal ölçekle ilişkili melanositlerinde transkripsiyon faktörleri ekspresyonunu tespit etmek için antikor boyama yöntemi açıklanmaktadır. Bu immün boyama tekniği, transgenik zebra balığında melanosit ile indüklenen transfeksiyon faktörü-A'nın spesifik olarak tanımlanmasına yardımcı olur.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

>1. Ölçek Melanositlerinin Antikor Boyaması

1. 80 mL 0.1M Na₂HPO₄ ve 20 mL 0.1M NaH₂PO₄ ile PO 4 tamponu oluşturun. PH'ın 7.3 olduğundan emin olun. 8.0g sükroz, 0.15 mL 0.2M CaCl2 ve 90 mL 0.2M PO ₄ tamponu, pH 7.3 içeren 2x sabitleme tamponu oluşturun. Gerekirse, NaOH veya HCl ile pH'ı 7.3'e ayarlayın, ardından PO₄ tamponu ile 100 ml'ye kadar yapın.
2. 300 mg katı PFA'ya kadar tartın ve bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. mg cinsinden 4.5 x kütleye eşit bir hacme 5 mM NaOH ekleyin PFA (ör. 450 ul 5 mM NaOH ila 100 mg PFA). PFA çözülene kadar ara sıra çalkalayarak 60-70 °C'de ısıtın. Kalan partikülleri döndürün ve %20 PFA süpernatanı geri kazanın. Her seferinde taze yapın.
3. 1x sabitleme tamponu ve% 4 PFA içeren sabitleme solüsyonu hazırlayın.
4. Balıkları 0.17 mg / mL trikadlı içinde uyuşturun.
5. Diseksiyon mikroskobu altında gelen ışığı kullanarak, ölçeğin melanosit içeren yarısına zarar vermemeye dikkat ederek keskin ince uçlu forseps kullanarak sırt pullarını koparın (Şekil 1A). Ölçekleri doğrudan forsepsten 1 mL fiksasyon solüsyonuna yerleştirin ve dönerken oda sıcaklığında ≥ 2 saat inkübe edin. Balıkları balık suyuna aktarın ve başarılı bir şekilde iyileşmeyi doğrulamak için balığı izleyin.
6. Pigmentli melanositleri ağartmak için, sabit pulları PBST'de (1x PBS pH 7.4,% 0.1 Triton X-100) oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2 kez yıkayın. 0.4 mL% 10 KOH ve% 0.15 mL% 30 H₂O₂ içeren 1 ml taze yapılmış ağartıcı solüsyonu ekleyin, dH₂O ile 5 mL'de. Gazın tüpleri patlatmasını önlemek için parafilm veya kapak kilitleri takın. Pigment gidene kadar ağartmaya devam edin (10 dakika tipiktir) (Şekil 1B, C). PBST'de oda sıcaklığında 5 dakika boyunca dört kez yıkayın.
7. 1x PBS pH 7.4,% 0.2 Triton X-100, 2 mg / mL BSA,% 1 DMSO,% 0.02_NaN3 ve% 2 kuzu serumundan oluşan blok çözeltisinde en az 30 dakika bloke edin. HRP reaksiyonu ile gelişiyorsa NaN_3'ü dışarıda bırakın.
Oda
8. sıcaklığında gece boyunca blok çözelti içinde birincil antikor ile inkübe edin. Numuneleri su altında tutmak için üzerinde en az 400 μL çözelti bulundurmanız gerekir.
9. Tartıları oda sıcaklığında PBST'de 30 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
10. İkincil antikor ile oda sıcaklığında blok çözelti içinde 2 saatten gece boyunca inkübe edin.
11. PBST + 0.1 μM DAPI ile 10 dakika boyayın.
12. PBST ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
13. Terazileri, pulların içbükey tarafı slayta doğru bakacak şekilde bir damla vectashield içinde bir cam slayt üzerine monte edin ve üzerlerine bir cam kapak kayma yerleştirin. Slaytın kenarlarını şeffaf oje ile kapatın ve slaytları floresan mikroskobu altında gözlemleyin (Şekil 1D, E, F, G).

Sonuçlar

Şekil 1. Ölçek melanositlerinin antikor boyaması. A) Anestezi uygulanmış bir mini CoopR-EGFP zebra balığından pullar koparılıyor. B) Pigmentli melanositler ile ağartılmamış pul ve C) miniCoopR-EGFP zebra balığından ağartılmış pul. Ölçek çubuğu = 100 μM. D) Mitfa antikoru ve E) DAPI ile boyanmış ağar...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ağ geçidi rekombinasyon reaktifleri	Canlandırıcı
miniCoopR
Mitfa antikoru
FITC keçi anti-tavşan IgG antikoru	Canlandırıcı
Vectashield (Kalkan	Vektör Laboratuvarları	H-1000
casper Zebra Balığı
701N 10 μl Şırınga	Hamilton/Balıkçı	14-824
FBS (FBS)	Canlandırıcı	26140079

) Serisi arası