Subkutan Transplantasyon Testi: Melanom Hücrelerini Bir Donörden Bir Alıcıya Nakletmek İçin Bir Yöntem Zebra Balığı Modeli

Özet

Kaynak: Iyengar, S. et al. Zebra Balığı Otokton Tümör Modeli Kullanılarak Melanom Değiştiricileri için Tarama. J. Vis. Uzm. (2012)

Bu videoda, tümör hücrelerinin melanom taşıyan donör zebra balığı modelinden bağışıklığı baskılanmış bir alıcı Casper zebra balığına nakli yöntemi açıklanmaktadır. Alıcı balıklarda tümör aşılamasını ve proliferasyonunu görselleştirmeye yardımcı olur.

Protokol

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Transplantasyon Testi

1. Alıcı 2-3 aylık Casper balığını, transplantasyondan bir gün önce 25 Gy gama ışınlaması ile ışınlayarak hazırlayın. Balığın balık suyunda iyileşmesine izin verin.
2. Tümör taşıyan bir balığı kurumsal yönergelere göre ötenazi yapın. Spesifik olarak, bir balık, solungaç hareketi durana kadar 0.6 mg / mL tricain içeren bir tabağa yerleştirilir.
3. Tümörü kesin ve yaklaşık 5 mL filtre, sterilize edilmiş 0.9x PBS, %5 FBS ile bir Petri kabına koyun. Çözelti içindeyken tümörü bir ustura ile doğrayın.
4. Oda sıcaklığında çalışarak, tek hücreler elde etmek için bir P1000 pipeti ile ezin. % 5 FBS ile sterilize edilmiş filtre, 0.9x PBS ile hacmi 25 mL'ye kadar tamamlayın.
5. 40 μM gözenekli filtreden süzün.
6. Eppendorf 5810R masa üstü santrifüjde 1.500 rpm'de (453 rcf) 10 dakika döndürün.
7. Süpernatanı çıkarın ve hücre süspansiyonunu kabaca istenen konsantrasyona getirin (100^mm'lik 3 tümör için 10⁷ hücre olduğunu varsayalım).
8. Bir hemositometre kullanarak tam hücre sayısını hesaplayın ve hücre süspansiyonunu, son enjeksiyon hacmi yaklaşık 5 μL olacak şekilde seyreltin. Örneğin, 50.000 hücre enjekte edilecekse, hücre süspansiyonu 10.000 hücre / μL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltilmelidir. Hücrelerin topaklanmasını önlemek için hücre süspansiyonunu içeren tüpü birkaç dakikada bir hafifçe vurun.
9. 26s gauge (konik uçlu) 701 N 10 μL Hamilton şırıngayı %100 etanol ve 0,9x PBS ile 2-3 kez yıkayın. Şırıngayı 5 μL hücre süspansiyonu ile yükleyin.
10. Işınlanmış alıcı balığı 0.17 mg / mL trikat içinde uyuşturun. Balıkları nemli bir Kimwipe üzerine yan yatırın (Şekil 1A).
11. Balığı bir elinizle sabitleyin ve iğneyi, eğim yukarı bakacak şekilde 45°'lik bir açıyla balığın yan tarafına, periton boşluğunun üzerinde, arka beynin arka sınırı ile sırt yüzgecinin ön sınırının yaklaşık yarısına kadar sokun. Pistona hafifçe bastırın (Şekil 1B).
12. Balığın taze balık suyunda iyileşmesine izin verin ve balığı tümör aşılaması açısından günlük olarak gözlemleyin (Şekil 1C). Aşılama meydana gelmişse, devam eden büyüme ve hastalık gelişimi de gözlemlenebilir.

Sonuçlar

Şekil 1. Melanom hücrelerinin nakli. A) Enjekte edilmemiş Casper zebra balığı. Ölçek çubuğu = 500 μM. B) 50.000 melanom hücresi ile enjeksiyondan hemen sonra ışınlanmış bir Casper alıcısında deri altı transplantasyon bölgesi (ok ucu). Ölçek çubuğu = 200 μM. C) 50.000 melanom hücresi ile enjeksiyondan iki hafta sonra ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ağ geçidi rekombinasyon reaktifleri	Canlandırıcı
miniCoopR
casper Zebra Balığı
701N 10 μl Şırınga	Hamilton/Balıkçı	14-824
40 μM filtre	BD Şahin/Balıkçı	352340
FBS (FBS)	Canlandırıcı	26140079

arası