$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Ortam ve Reaktiflerin Hazırlanması
- 200x L-askorbik asit 2-fosfat stoğunun hazırlanması
- Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM) çözeltisinin 5 mL'si başına 29 mg L-askorbik asit 2-fosfatı çözün ve 0.22 μm'lik bir membran filtreden süzün. -20 °C'de 0,25 mL steril alikotlar halinde saklayın.
- 0.1 mM L-askorbik asit 2-fosfat nihai konsantrasyonu için gereken günde her 50 mL fibroblast ortamına (% 1 L-glutamin ve% 10 fetal sığır serumu ile DMEM) 0.25 mL 200x L-askorbik asit 2-fosfat stoğu ekleyin.
- Keratinosit büyütme ortamının hazırlanması
- Primer skuamöz hücreli karsinom (SCC) keratinositlerinin izolasyonu ve kültürü daha önce tanımlanmıştır. Keratinosit büyüme ortamının hazırlanması da burada anlatılmaktadır.
- Kısaca medyayı şu şekilde hazırlayın:
300 mL DMEM ve 100 mL Ham'ın F-12'si %10 FBS
ile desteklenmiştir
0.4 mg / mL hidrokortizon
5 mg / mL insülin
10 ng/mL EGF
5 mg / mL transferrin
8.4 ng/mL kolera toksini
13 ng / mL liotironin
1x penisilin-streptomisin çözeltisi
2. L-Askorbik Asit 2-Fosfat Takviyeli Ortamda Fibroblast Türevli Doğal Matriksin İn vitro Yapısı
- L-askorbik asit 2-fosfat ile takviye edilmiş fibroblast ortamında 6 oyuklu plakalarda (20.000 hücre /cm2) kuyu başına 200.000 fibroblast tohumlayın. Her 2-3 günde bir 2-5 mL medya ile yeniden besleyin. (Not: Yeniden besleme frekansı ve hacmi, farklı hücrelerin bireysel ihtiyaçlarına uyacak şekilde ayarlanabilir.)
- 6 haftanın sonunda çıplak gözle görülebilen hücre dışı matriks içine gömülü kalın bir hücre tabakası oluşacaktır (Şekil 1). Bu tabakayı doku kültürü plakasından çıkarmak için, matrisin çevresini 1 mL'lik bir mikropipet ucuyla nazikçe kazıyın ve ardından matrisin kenarlarını kuyunun merkezine doğru itin. Bu hücre ve matris tabakası (doğal matris) plaka yüzeyinden kolayca ayrılabilir olmalı ve şimdi ortamda yüzer olmalıdır. Kendi üzerine katlanmasını önlemek için yerel matrisi medyaya yayın.
- Yerel matrisin 5 gün boyunca yüzmesine ve yeniden şekillenmesine izin verin, her 2-3 günde bir ortam değiştirin. Matris içindeki gerilme mukavemeti ve içsel yeniden şekillenme nedeniyle, matris büyük ölçüde büzülecek ve istila tahlili için kullanılmaya hazır daha küçük, ancak daha kalın bir doğal matrise indirgenecektir.
3. Tümör SCC Keratinositleri ile İnvazyon Testi
- Doğal matrisi künt forseps ile nazikçe alın ve Naylon ağa aktarın. Naylon ağa girdikten sonra, 1 mL'lik bir mikropipet ucu ve künt forseps kullanarak matrisi mümkün olduğunca düz duracak şekilde nazikçe yayın.
- Bir ucuna az miktarda steril Vazelin sürerek steril klonal silindirleri hazırlayın.
- Klonal silindirleri, Vazelin tarafı aşağı bakacak şekilde yerel matris üzerine yerleştirin. Bu, doğal matris ile klonal halkalar arasında sıkı bir sızdırmazlık sağlamak içindir.
- Klonal silindirlere cSCC hücreleri ekleyin (100 μl keratinosit büyüme ortamında 250.000 hücre).
- cSCC hücreleri doğal matris üzerine yerleştiğinde 6 saat sonra klonal silindirleri çıkarın.
- Doğal matris ve cSCC hücreleri ile Naylon ağı, bükülmüş paslanmaz çelik tel örgü desteği üzerine hava-sıvı arayüzüne kaldırın.
- Ortam seviyesi doğal matrisin dibine değene kadar askorbik asit ile desteklenmiş keratinosit büyüme ortamı ekleyin.
- Besiyerini her 2-3 günde bir değiştirin ve cSCC hücrelerinin tohumlanmasından sonra 7 ve 14 günde hasat edin.
