Plazmid DNA influenza A virüsleri Kurtarma grip araştırmacılar grip virüsünün biyoloji çeşitli yönlerini incelemek amacıyla rekombinant virüsler üretmek için, ve potansiyel vektörler veya aşı olarak kullanılmak üzere izin veren bir temel ve temel deneysel bir tekniktir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi
Bu makalede
Özet
Özet
Grip araştırma grupları bir takım çabalar, influenza A virüsünün ters genetik geliştirme ve iyileştirme kilit edilmiştir. 1999 yılında kurulmuş.
Protokol
1. İnfluenza virüs kurtarma transfeksiyon
İnfluenza A virüsü negatif iplikli RNA zarflı virüs Orthomyxoviridae ailesine aittir. Influenza A virüs genomunun en az 11 viral proteinler (Şekil 1) 4, kodlamak negatif polarite sekiz farklı RNA genleri oluşur. (8 grip A/PR/8/34 viral segmentleri içeren ambisense plazmid (pDZ) kullanarak en sık rastlanan laboratuvar suşu, grip A/PR/8/34, 5 kurtarma, bu raporda, durulacak Şekil 2).
Plazmid DNA rekombinant influenza virüslerinin kurtarılması için, biz her rekombinant virüs başına 3 bağımsız transfections tavsiye ederiz. Birden fazla rekombin....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Plazmid DNA rekombinant influenza virüslerinin Kurtarma sonra protokol rutin laboratuarda gerçekleştirilen basit ve kolay bir süreç, ama başında, birden fazla şeyler ters gidebilir. Virüs oluşturmak için iyi bir plazmid hazırlanması zorunludur. (293T ve MDCK) hücre hatları doğru bakım başarılı bir viral kurtarılması için çok önemlidir. Geleneksel olarak, genetik bir etiket sessiz mutagenez, bir grip plazmid gen kodlama içine eklenir. Bu sessiz mutasyon (lar) ve örneğin, yaratılış giriş, bir roman restriksiyon enzimi sit.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Mount Sinai Tıp Fakültesi, rekombinant influenza virüslerinin alanda fikri mülkiyet hakları, ve AG-S, bu fikri mülkiyet bir mucit.
Teşekkürler
Yazarlar grip ters genetik teknikler ve plazmid gelişimi için Adolfo Garcia Sastre ve Peter Palese laboratuvarlar geçmişteki ve şimdiki üyelerine teşekkür etmek istiyorum. AG-S laboratuarlar Araştırma Crip, Grip Araştırma ve Gözetim Mükemmellik NIAID tarafından finanse edilen Merkezi (HHSN266200700010C) ve NIAD hibe R01AI046954, U01AI070469 ve P01AI058113 tarafından kısmen finanse edilmektedir. LM-S laboratuvar Araştırma kısmen NIAID hibe RO1AI077719 tarafından finanse edilmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
Hücre dizileri
293T (katalog numarası CRL-11268) ve MDCK (katalog numarası CCL-34) hücre hatları DMEM% 10 FBS,% 1 PS% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör tutulur. Hücreler American Type Culture Collection (ATCC 10801 Üniversitesi Bulvarı, Manassas, VA 20.110-2209 ABD) bulunan bir biçimidir.
Embriyolu tavuk yumurtası
Charles River Laboratuvarları, Özel Patojen Ücreti Kuş Kaynağı (SPAFAS) Kuş Ürünler ve Hizmetler embriyolu 10 günlük civciv yumurta elde edilebilir. Franklin Commons, 106 Route 32, Kuzey Franklin, CT 06.254 ABD. Yumurtalar 37 ° C önceki ve viral enfeksiyondan sonra inkübe edilir. Viral enfeksiyon önce ve sonra, yumurta, embriyo canlılığını belirlemek için candled vardır. Bu viral enfeksiyon öncesi ve sonrasında ölü yumurta bakmak için çok önemlidir. Önce ölü bir yumurta bulaşmış kan damarlarının olmaması yanı sıra embriyo hareketlilik olmaması tespit edilebilir. Candled, canlı embriyolarının hareket eder. Viral enfeksiyondan sonra ölü bir yumurta (muhtemelen influenza virüs enfeksiyonu ile ilgili) kolayca allantoik sıvı hacmi küçük ve kanlı görüldüğü gibi yumurtanın kötü görünüşü fark olacaktır. Etkilenmiş-yumurta çift otoklav torbaları atılır ve standart prosedürler takip otoklavlanırlar.
Tavuk kırmızı kan hücreleri (eritrosit)
Tavuk RBC Truslow Çiftlikleri, 201 Valley Road, Chestertown, Md 21620 satın alınabilir. 4 ° C saklayınız HA deneyleri için tavuk RBC 5 ml, 45 ml, 50 ml santrifüj tüpüne PBS 1X yıkayın. 1000 rpms, RT az 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatle atın ve PBS 1X pelet RBC 1:1000 dilüsyon (0.5-1.0% RBC final konsantrasyon) kullanabilirsiniz.
Doku kültürü süpernatantlar ve allantoik sıvıları
, Doku kültürü süpernatantlar ve allantoik sıvıları, 4 ° C, kısa bir süre için saklanabilir. Virüs kurtarma onayladıktan sonra, hücre süpernatantlar virüs veya allantoik sıvı -80 ° C'de saklanır.
Plazmidler
Plazmid plazmid maxi kiti aşağıdaki üretici öneriler kullanılarak hazırlanmıştır. Tüm plazmid GKD 2 O 1 mcg / ml konsantrasyonlarda kısım ve -20 ° C'de saklanan Kısa süreli depolama için, 4 tutmak plazmid olabilir ° C Plazmid saflaştırılmış DNA konsantrasyonu, saflığı 260:280 nm oranı kullanılarak tahmin, 260 nm'de spektrofotometre tarafından belirlenir. 1,8-2,0 260:280 nm oranları ile hazırlıklar virüs kurtarma amaçlı tahsis kabul edilir. Ayrıca, plazmid konsantrasyonu ve saflık agaroz jel kromatografisi ile teyit edilmelidir. Ambisense pDZ plazmid (6), sekiz grip A/PR/8/34 viral genler (7) içeren Şekil 2'de gösterilmiştir.
Virüsler
Grip A/PR/8/34 kurtarmak için açıklanan protokol biyogüvenlik düzeyi (BSL) 2 koşulları altında yapılabilir. Doku kültürü süpernatantlar ve embriyolu yumurta da dahil olmak üzere kontamine malzeme, atmadan önce sterilize edilmelidir. Diğer grip virüsü Kurtarma yüksek BSL koşulları ve bu nedenle, özel koşullar / güvenlik ölçümleri takip gerekecektir gerekebilir.
Doku kültürü medya ve çözümler
DMEM% 10 FBS% 1 PS: 445 ml Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (DMEM), fetal sığır serumu (FBS) 50 ml ve 5 ml 100X Penisilin / Streptomisin (PS). 4 ° C saklayınız Bu ortam transfections 293T ve MDCK hücreleri gibi korumak için kullanılır. DMEM% 0.3 BA% 1 Not: DMEM 495,7 ml, 4.3 ml% 35 Bovine Albumin (BA). 4 ° C saklayınız Kullanmadan önce, son bir 1 mg / ml konsantrasyonu TPCK tedavi tripsin ekleyin. Enfeksiyon medya.
80 g NaCl, 2 g KCl, Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 2 g KH 2 PO 4 11,5 g: 10X fosfat tamponlu salin (PBS). 1 litre kadar GKD 2 O ekleyin. PH 7.3 'e ayarlayın. Otoklav ile sterilize edin. Oda sıcaklığında saklayın.
1X PBS: GKD 2 O. ile seyreltin 10X PBS 01:10 Oda sıcaklığında ve mağaza otoklav ile sterilize edin.
Kaynaklar
- Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).
- Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
